阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是一种神经退行性疾病^［1-3］，在全球范围内发病率及死亡率均呈上升趋势，且发病年龄呈年轻化趋势。据《2024年中国阿尔茨海默病报告》统计，我国的AD及其他痴呆导致死亡、患病及伤残调整生命年等相关标化指标均高于全球水平，提示我国在应对AD这一公共卫生挑战上面临严峻考验^［1］。AD的病理特征包括β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein， Aβ）沉积、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结、神经元丢失以及突触损伤。在AD的发病机制研究中， Aβ级联假说被公认是经典学说之一^［4-5］，即淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）代谢异常，不仅导致β分泌酶切割途径激活，同时改变γ分泌酶切割位点偏好性，使APP剪切过程中产生更多毒性Aβ沉积，进而触发神经元损伤、突触功能障碍及脑区特异性神经元死亡。研究表明，APP基因突变可通过增强β分泌酶切割效率或促进Aβ1-42生成显著加速淀粉样斑块沉积^［6-7］。常见的APP突变类型有Swedish、London和Austrian突变^［8-9］，其是家族性AD的重要诱因^［10］。精准模拟APP异常代谢的动物模型对解析AD病理机制及药物研发至关重要。使用人源性的突变APP导入实验动物脑海马区可以构建模拟遗传突变类型的AD模型。

啮齿类实验动物小鼠常用于AD转基因模型^［11-12］。与小鼠相比，大鼠在认知、行为、大脑结构及药物代谢上更接近人类^［13-14］，且寿命长、体型大，便于操作与采样，更适合构建AD模型。近年来，基于病毒载体的基因递送技术为AD模型构建提供了新策略。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）凭借其高转导效率、低免疫原性、跨血脑屏障能力及精准的脑区靶向性^［15］，成为神经科学研究中理想的基因递送工具。本研究拟通过脑立体定位注射携带人源三突变（Swedish/London/Austrian）APP基因的AAV载体，构建AD大鼠模型，以期更真实地模拟Aβ异常沉积的病理进程，为深入探究AD发病机制和药物开发提供研究基础。

24只SPF级雌性SD大鼠均12周龄，体重为（250±20）g，购自广西医科大学实验动物中心［SCXK（桂）2020-0003］。动物饲养于广西医科大学实验动物中心的动物实验室屏障系统［SYXK（桂）2020-0004］，相对湿度50%～60%，温度22～24 ℃，大鼠可自由饮水和进食。本实验方案通过广西医科大学实验动物伦理委员会的伦理审查（编号为202404010）。所有动物实验操作遵循实验动物伦理福利3R原则。

重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）-APPs1a-Nluc和rAAV-Nluc购自武汉枢密脑科学技术有限公司，均为定制产品；RNA提取试剂盒（批号S20205）、RNA反转录试剂盒（批号R31107）、实时荧光定量PCR试剂盒（批号R10101）均购自北京全式金生物技术股份有限公司；活体成像萤光素酶底物Furimazine（批号162434）购自上海陶素生物科技有限公司；即用型免疫组化SP试剂盒（批号246289710D）购自福州迈新生物技术开发有限公司；Aβ蛋白抗体（批号B430350）购自美国BioLegend公司。

小动物活体成像仪购自美国PerkinElmer公司；SMART 3.0小动物行为学记录分析系统、旷场箱、大鼠新物体识别实验玩具、双通道小动物麻醉机、大鼠脑立体定位气麻呼吸面罩和异氟烷（批号20211520）均购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；荧光定量PCR仪（型号QuantStudio 7 Flex）购自美国Thermo Fisher公司；石蜡包埋与切片机（型号RM2235）和生物显微镜（型号BX53）均购自德国Leica公司。

采用rAAV载体构建技术^［16］，构建携带人源三突变APP基因的rAAV载体。以携带NanoLuc萤光素酶基因的AAV质粒为骨架载体，整合AAV2血清型的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）作为病毒基因组复制与包装的顺式作用元件，用在辅助质粒上单独表达的AAV9血清型衣壳蛋白基因（Cap）构建病毒外壳，在NanoLuc萤光素酶基因前插入含Swedish（K670N/M671L）、London（V717I）及Austrian（T714I）三重突变的APP cDNA序列，构建实验组病毒载体质粒。空载病毒质粒不携带人源APP cDNA序列。

空载病毒以及目的病毒的载体结构如图1所示。目的载体携带人源三突变APP基因以及NanoLuc萤光素酶基因，两个基因共用一个启动子，NanoLuc萤光素酶基因位于APP基因之后，若萤光素酶基因成功表达则可推测位于前面的APP基因也成功表达对应蛋白。两者间用P2A肽隔开，使两个蛋白独立表达，以免影响蛋白后续修饰。空载病毒和目的病毒相比，除了缺少人源三突变APP基因外，其他部分皆相同。

将24只SD大鼠随机分为空白对照组（blank control group，BC）、空载病毒组（virus control group，VC）以及实验组（experimental group，Exp），每组8只。空白对照组不做处理，空载病毒组注射AAV空载体（rAAV-Nluc），实验组大鼠注射携带人源三突变APP基因的AAV（rAAV-APPs1a-Nluc）载体质粒。

将大鼠置于气体麻醉诱导盒内用异氟烷麻醉后，剃去大鼠头部区域毛发，用75%乙醇溶液对皮肤进行消毒，以脑立体定位气麻呼吸面罩维持麻醉，并固定于脑立体定位仪上，暴露大鼠颅骨上的前囟点和后囟点并调节仪器参数：脑立体定位注射位置为正中矢状缝左右旁开2 mm，前囟后3.3 mm，硬脑膜下进针深度3 mm，坐标（±2，-3.3，-3）。使用牙科钻钻至硬脑膜表面后，用5 μL规格的无菌微量注射器进行病毒注射，双侧脑区各注射2 μL 1×10¹³ vg/mL的病毒悬液。注射完成后用骨蜡填充注射孔，缝合头皮，碘伏消毒后放回笼中饲养。

病毒注射后2周及6个月时，称量各组大鼠体重，按照每100 g体重腹腔注射5 mmol/L的萤光素酶底物Furimazine 0.23 mL，注射10～15 min后，将大鼠进行异氟烷气体麻醉，待动物失去知觉后，立刻放入活体成像仪中维持麻醉，调整参数进行生物发光拍照和记录结果。

注射病毒6个月后进行各组大鼠的新物体识别实验，具体操作如下：将大鼠放入旷场箱熟悉5 min，将两个完全相同的圆柱体放入旷场箱一侧靠边缘位置；将大鼠再次放入旷场箱中，让其探索10 min，记录大鼠与物体的互动情况；1 h后，将其中一个圆柱体替换为不同颜色的圆锥体，再次将大鼠放入旷场箱中，让其探索10 min，记录大鼠对新旧物体的探索时间、次数等。每次测试结束后，将大鼠放回饲养笼，清洁旷场箱以消除气味。由行为学分析系统识别动物运动轨迹，得出探索时间，然后通过计算新物体识别指数（recognition index，RI）来判断大鼠的学习记忆能力。RI时间值=探索新物体时间/（探索新物体时间+探索旧物体时间），RI距离值=探索新物体距离/（探索新物体距离+探索旧物体距离）。

行为学实验后，每组随机取4只大鼠，称量其体重，按50 mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，颈椎脱臼处死大鼠。剥离脑组织，摘取海马体，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。根据人类三突变APP基因和大鼠APP基因的保守区域序列（来源于NCBI网站）设计引物，可同时扩增2种基因，上游引物为5’-ACTGACCACTCGACCAGGTTC-3’，下游引物为5’-GGCGTCAACCTCCACCACA-3’。内参基因β-actin的上游引物为5’-TGTCACCAACTGGG-ACGATA-3’，下游引物为5’-GGGGTGTTGAAGGTC-TCAAA-3’。按照试剂盒说明书步骤提取RNA，并逆转录，对APP基因进行实时荧光定量PCR扩增，反应程序：94 ℃ 30 s预变性；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环扩增40次。反应结束后导出Ct值等数据，运用2^-ΔΔCt法计算相对表达量，并进行统计学分析。同时，对实时荧光定量PCR扩增产物采用测通法测序验证。PCR引物合成及扩增产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

每组取另外3只大鼠用于组织病理学检测（剩余1只为备用）。大鼠麻醉后用生理盐水灌注心脏以置换血液，再用4%多聚甲醛溶液灌注后剥离脑组织。将脑组织浸泡于4%多聚甲醛溶液固定48 h后，用梯度乙醇溶液常规脱水、二甲苯透明后浸蜡包埋，石蜡切片4 μm。分别采用HE染色法、尼氏染色法、免疫组织化学法检测大鼠海马区脑组织的常规组织病理特征、神经元变化以及Aβ沉积情况。

HE染色：石蜡切片脱蜡后先用苏木精染色细胞核，分化后再用伊红染液染色；倾去多余染色液后快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

尼氏染色：石蜡切片脱蜡后，用尼氏染色液浸染10 min；自来水洗去多余染液，用尼氏分化液分化30 s，终止分化。显微镜下初步观察染色情况，显色清晰即可用乙醇溶液梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡，EDTA热修复后，进行内源性过氧化物酶阻断和血清封闭；加入Aβ单克隆抗体4 ℃过夜孵育，漂洗后再加入生物素标记的山羊抗鼠/兔二抗于室温孵育30 min，DAB显色后加入苏木精对比染色细胞核；显微镜下初步观察，染色正常则脱水封固，然后在光学显微镜下进行观察和拍照。

采用SPSS 22.0软件对各实验结果数据进行分析处理。符合正态分布且方差齐性的各组数据采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布和方差齐性要求的数据用Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。

造模2周后，腹腔注射萤光素酶底物Furimazine进行各组大鼠活体成像（图2），结果显示，实验组与空载病毒组大鼠头部区域可检测到荧光发光，空白对照组大鼠未检测到荧光；造模6个月后实验组和空载病毒组的荧光强度都减弱，但仍然可以被检测到。结果证明造模后大鼠脑部有效表达rAAV。

rAAV感染后，受试大鼠的新物体识别实验结果（图3）表明，实验组的距离认知指数和时间指数均明显低于空白对照组（P<0.01）和空载体病毒组（P<0.05），而空白对照组与空载病毒组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结果提示造模后大鼠的认知记忆能力明显下降。

造模6个月后，实时荧光定量PCR检测各组大鼠海马体中APP基因的相对表达量，结果如图4A所示。实验组APP相对表达量与空白对照组和空载病毒组相比显著增高（P<0.01），而空白对照组与空载病毒组相比差异无统计学意义（P>0.05）。PCR产物测序结果与正常人源APP基因序列比对结果如图4B所示，精准定位到3个突变位点，分别为Swedish突变位点GA突变为TC，Austrian突变位点C突变为T，London突变位点G突变为A。以上突变位点的位置与rAAV载体所设计的预期突变位点完全相符。

rAAV病毒感染大鼠6个月后，海马体的HE染色结果如图5A所示。实验组大鼠的海马体CA1区神经细胞缺失、皱缩、分布稀疏；空白对照组和空载病毒组CA1区神经元细胞结构完整，细胞数量正常，神经元细胞排列整齐，细胞核大圆且染色清晰。

尼氏染色结果如图5B所示。实验组海马体中尼氏体数量减少，分布稀疏，染色浅淡；空白对照组和空载病毒组的海马体中尼氏体丰富，染色可见形态饱满、色深而匀、数量多而密、排列紧致。

免疫组织化学染色结果如图5C所示。实验组大鼠的海马CA1区及锥形细胞层可以看到明显的棕褐色沉淀，即产生了Aβ沉积；空白对照组以及空载病毒组在海马区未看到Aβ沉积现象。

AD作为一种复杂的神经退行性疾病，目前尚无完全治愈该疾病的方法。近20年来，全球首个获美国食品药品监督管理局批准的AD新药仑卡奈单抗，也只能通过清除大脑中的有毒Aβ蛋白，延缓疾病的临床进程。该疾病不仅对患者的身心健康和生活质量造成了极大的危害，也给家庭和社会带来了沉重的负担。近年来，国内外AD患者数量与日俱增，使得该疾病研究刻不容缓，而构建良好的疾病模型对疾病的治疗研究具有至关重要的作用。

灵长类动物与人类的亲缘关系很接近，在构建人类疾病动物模型上具有天然的优势，然而受限于伦理问题和高昂的实验成本，难以作为可推广的实验动物用于研究。所以，目前的AD模型构建大多用大鼠和小鼠。相比于小鼠，大鼠具有更接近人类的神经解剖结构、行为复杂性和代谢特征。本研究在综合考虑成本、病理生理特征及其下游研究价值后，选择大鼠作为构建AD模型的实验动物。

Aβ异常沉积是AD的核心病理标志之一，其生成直接归因于APP的异常剪切^［17-18］。家族性AD患者中，约50%的病例与APP基因突变相关，尤其是Swedish、London及Austrian突变，因其对Aβ生成的关键调控作用而被广泛关注。造模时引入人APP基因可规避物种差异，精准模拟人类AD的Aβ沉积特征。本研究采用大脑感染携带Swedish/London/Austrian突变位点的APP基因的病毒进行造模，6个月后组织学观察结果显示，海马区神经元数量减少，形态出现萎缩，尼氏体数量减少，分布稀疏，染色浅淡，出现了明显的Aβ沉积，此变化与人类AD患者的病理特征一致^［2］。新物体识别行为学实验发现，实验组大鼠的认知能力显著降低，认知记忆能力衰退，有效模拟了人类AD的临床疾病特征。在现有AD大鼠模型中，也有通过转入APP基因进行造模的文献报道，例如有研究者向Tg6590大鼠转入携带Swedish突变位点的APP基因^［19-20］，但该模型出现行为认知障碍的时间需9个月甚至更长，出现Aβ沉积的时间在15个月以上，成模时间过于漫长；而且该模型动物出现的AD病理特征比较单一，不如本研究中转入三突变APP基因的造模效果好。

目前有不少研究者通过基因编辑技术进行AD造模^［21-22］。清华大学研发的APP^NL-G-F转基因大鼠不仅检测出Aβ沉积，6个月后还检测出Tau蛋白磷酸化、突触缺失等特征^［14］，较好地模拟了AD疾病特征；但12个月后才检测出神经元缺失，且胚胎显微注射技术难以避免脱靶效应，不仅限制了目的基因在特定组织功能的研究，而且可能会导致动物发生与AD无关的不良后果。例如有研究发现，Tau转基因小鼠的脊髓出现了细胞坏死，导致后肢残疾，且随着年龄增长，后肢的残疾加重，寿命只有5～6个月^［23］。

另外，还有研究者直接通过脑立体定位注射Aβ进行造模^［24］，能在短时间内诱导局部神经炎症，但同时容易激起机体免疫反应，且不符合AD患者脑内Aβ沉积来自长期积累的临床发病机制。而本研究通过高效转导低免疫原性的AAV在大鼠脑内持续表达APP基因，进而形成Aβ沉淀，可以更近似地模拟AD的发病进程。

NanoLuc萤光素酶作为基因标记，与传统的萤光素酶相比，具有体积小（约19 kDa）、亮度高、稳定性好的优点，结合底物Furimazine后可发出强烈蓝光，可透过头骨被活体成像仪捕捉，实现了高灵敏度、低背景的生物发光检测^［25-26］。本研究中将三突变APP基因与NanoLuc萤光素酶基因共用一个启动子，这种单载体共表达系统避免了多载体共转染的效率不均问题，使得NanoLuc萤光素酶的发光信号可以更准确地指示APP基因的表达情况。

本实验采用脑立体定位仪直接注射携带APP基因的AAV，利用活体成像仪可快速高效地观察造模效果，对动物创伤小，检测的灵敏度高，无需额外注射易淬灭的荧光抗体或牺牲动物获取组织样本，显著简化了实验流程并符合动物实验伦理的3R原则。此设计不仅为AD病理机制研究提供了高效工具，更为大型动物（如非人灵长类）或难以基因编辑的物种提供了造模参考，规避了转基因动物繁育的高耗时与高成本限制。

综上，本研究通过脑立体定位技术联合AAV转入人源三突变APP基因成功构建的大鼠AD模型，可体现出典型的AD组织病理学和认知行为特征，为基于Aβ沉积的AD病理研究及药物研发提供了动物模型基础。

肖林林, 杨逸萱, 黎珊杉, 等. 利用脑立体定位技术将人源三突变APP基因导入海马区构建阿尔茨海默病大鼠模型[J]. 实验动物与比较医学, 2025, 45(3): 269-278. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.030.

XIAO L L, YANG Y X, LI S S, et al. Establishment of a rat model ofAlzheimer's disease by introducing human triple mutant APPgene into hippocampus via brain stereotactic technology[J]. LabAnim Comp Med, 2025, 45(3): 269-278. DOI: 10.12300/j. issn.1674-5817.2025.030.