小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立及在部分啮齿类动物的应用

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2020.02.002

实验动物与比较医学 ›› 2020, Vol. 40 ›› Issue (2): 95-103.DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2020.02.002

小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立及在部分啮齿类动物的应用

王吉, 王莎莎, 付瑞, 王淑菁, 李威, 秦骁, 黄宗文, 李晓波, 巩薇, 岳秉飞, 贺争鸣

中国食品药品检定研究院国家实验动物微生物遗传检测中心, 北京 102629

收稿日期:2019-08-12 出版日期:2020-04-25 发布日期:2020-12-18
作者简介:王吉(1974-), 女, 硕士, 研究员, 从事微生物与免疫学研究。Email: wj_nd_jds@sina.com。共同第一作者: 王莎莎(1989-), 女, 免疫学硕士研究生。E-mail: wangsha0316@126.com
基金资助:
国家科技支撑计划(2015BAI09B02)

Establishment of Real-time Fluorescent Quantitative PCR Method for Mouse Hepatitis Virus and Application in Some Rodents

WANG Ji, WANG Shasha, FU Rui, WANG Shujing, LI Wei, QIN Xiao, HUANG Zongwen, LI Xiaobo, GONG Wei, YUE Bingfei, HE Zhengming

National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animal, Beijing 102629, China

Received:2019-08-12 Online:2020-04-25 Published:2020-12-18

摘要/Abstract

摘要： 目的建立小鼠肝炎病毒(MHV)实时荧光定量PCR检测方法,并初步应用于实验裸鼹鼠等啮齿类动物的检测。方法选择MHV E基因保守区域设计合成特异性引物和探针,建立荧光定量PCR方法,并对方法特异度、敏感度、线性、重复性和稳定性进行方法学验证。同时用建立的方法对79只清洁级小鼠、35只SPF小鼠、63只裸鼹鼠、10只长爪沙鼠、20只金黄仓鼠和4只黄鼠进行MHV检测。结果成功建立了MHV实时荧光定量PCR方法;方法的线性范围为(1×10¹~1×10⁹)拷贝/μL,与仙台(SV)病毒、呼肠孤病毒3型(Reo3)、小鼠肺炎病毒(PVM)、牛冠状病毒(BCV)均无交叉反应,方法的检测敏感度为10 拷贝/μL。重复性和稳定性试验显示实验间变异系数均小于5%。检测结果显示63只裸鼹鼠、35只SPF小鼠、10只长爪沙鼠、20只金黄仓鼠和4只黄鼠均为阴性。79只清洁级小鼠MHV阳性率为22.78%。建立的方法与RT-PCR比较,可信度达97.47%。结论建立的MHV荧光定量PCR方法特异、敏感,能够对多种啮齿类动物体内携带的MHV进行检测。

关键词: 小鼠肝炎病毒, 实时荧光定量PCR方法, 啮齿类动物

Abstract: Objective To establish a real-time fluorescent quantitative PCR (Q-PCR) method for detection of mouse hepatitis virus (MHV) in naked mole-rats and other rodent animals. Methods The specific primers and probe were designed and synthesized by selecting conserved regions of MHV E gene to establish the Q-PCR method. Then the linearity, specificity, sensitivity, repeatability and stability of this method was verified. Meanwhile, the established method was used to detect 79 clean grade mice, 63 naked mole-Crats, 35 SPF mice, 10 Mongolian gerbils, 20 golden hamsters and 4 ground squirrels for MHV. Results The real-time fluorescent quantitative PCR method for MHV was successfully established. The linear range of the method was 10¹ copies/μL to 10⁹copies/μL. The method has no cross reaction with Sendai (SV), reovirus type 3 (Reo3), pneumonia virus of mice (PVM), bovine coronavirus (BCV).The detection sensitivity could reach 10 copies/μL, the results of repeatability and stability showed that the coefficient of variation between experiments was less than 5%.The positive rate of MHV in 79 clean grade mice was 22.78%, and that of 63 naked mole-Crats, 35 SPF mice, 10 Mongolian gerbis, 20 golden hamsters and 4 ground squirrels were all negative. Established method was compared with RT-PCR, the coincidence rate was 97.47%. Conclusion The established Q-PCR method for MHV is good in linearity and specificity, it can be used for the detection MHV in multiple varieties rodents.

Key words: Mouse hepatitis virus, Real-time fluorescent quantitative PCR, Rodents

中图分类号:

R372
Q93-335

王吉, 王莎莎, 付瑞, 王淑菁, 李威, 秦骁, 黄宗文, 李晓波, 巩薇, 岳秉飞, 贺争鸣. 小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立及在部分啮齿类动物的应用[J]. 实验动物与比较医学, 2020, 40(2): 95-103.

WANG Ji, WANG Shasha, FU Rui, WANG Shujing, LI Wei, QIN Xiao, HUANG Zongwen, LI Xiaobo, GONG Wei, YUE Bingfei, HE Zhengming. Establishment of Real-time Fluorescent Quantitative PCR Method for Mouse Hepatitis Virus and Application in Some Rodents[J]. Laboratory Animal and Comparative Medicine, 2020, 40(2): 95-103.

参考文献

[1] 田克恭. 实验动物病毒性疾病[M]. 北京: 中国农业出版社, 1992:76-83.
[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京: 科学出版社, 1997:692-694.
[3] 徐耀先, 周晓峰, 刘立德. 分子病毒学[M]. 武汉: 湖北科学技术出版社, 2000:324-330.
[4] Kuo L, Masters PS.Genetic evidence for a structural interaction between the carboxy termini of the membrane and nucleocapsid proteins of mouse hepatitis virus[J]. J Virol, 2002, 76(10):4987-4999.
[5] Yang Z, Du J, Chen G, et al.Coronavirus MHV-A59 infects the lung and causes severe pneumonia in C57BL/6 mice[J]. Virol Sin, 2014, 29(6):393-402.
[6] 陈雪婷, 刘佳. MHV研究进展[J].2018, 解剖学进展, 24(4):438-440, 443.
[7] Asano A, Torigoe D, Sasaki N, et al.Identification of antigenic peptides derived from B-cell epitopes of nucleocapsid protein of mouse hepatitis virus for serological diagnosis[J]. J Virol Methods, 2011,177(1):107-111.
[8] 王吉, 卫礼, 付瑞, 等. 长爪沙鼠MHV RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国比较医学杂志, 2013, 23(2):58-63.
[9] Singh M, Kishore A, Maity D, et al.A proline insertion-deletion in the spike glycoprotein fusion peptide of mouse hepatitis virus strongly alters neuropathology[J]. J Biol Chem, 2019, 294(20):8064-8087.
[10] 赵善民, 崔淑芳. 裸鼹鼠生物学特性的研究进展[J]. 实验动物与比较医学, 2013, 33(5):400-405.
[11] 崔淑芳. 裸鼹鼠在生物医学研究中的应用前景[J]. 中国实验动物学报, 2016, 24(3):313-320.
[12] Lagunas-Rangel FA, Chávez-Valencia V.Learning of nature: The curious case of the naked mole rat[J]. Mech Ageing Dev, 2017, 164:76-81.
[13] 王吉, 卫礼, 付瑞, 等. 猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用[J]. 中国比较医学杂志, 2014, 24(12):50-57.
[14] 王吉, 付瑞, 李晓波, 等. 牛副流感病毒3型(BPIV3)实时荧光定量PCR检测方法的建立及在牛源样本检测中的应用[J].中国病毒病杂志, 2018, 8(5):393-399.
[15] 王莎莎, 王吉, 岳秉飞. 牛冠状病毒(BCV)实时荧光定量PCR检测方法的的建立及初步应用[J]. 中国比较医学杂志, 2019, 29(4):69-73.
[16] 王吉, 付瑞, 冯育芳, 等. 北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型的分离及鉴定[J]. 病毒学报, 2018, 34(5):744-753.
[17] 杨文静, 崔淑芳. 普通级封闭群裸鼹鼠种群的建立及其生物学特性的研究进展[J].中国实验动物学报, 2018, 26(4):518-522.
[18] 应贤平, 钱琴, 刘连生, 等. 清洁级长爪沙鼠病毒抗体ELISA检测方法的建立[J]. 中国实验动物学杂志, 1995, 15(1):24-27.
[19] 肖邦, 赵善民, 林丽芳, 等. 裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究[J].实验动物与比较医学, 2014, 34(5):422-427.
[20] 李欣悦. 小鼠三种病毒核酸检测方法的优化及与血清学检测结果的对比分析[D]. 北京: 北京协和医学院, 2018.
[21] 熊炜, 蒋静, 张强, 等. MHV核酸快速检测方法的建立和应用[J]. 实验动物科学, 2013, 30(4):1-5.
[22] GB/T 14926.2-2011. 实验动物微生物学等级及监测[S].
[23] DB11/1461.5-2018. 实验长爪沙鼠微生物学等级及监测[S].
[24] DB33/T2110.1-2018. 实验长爪沙鼠微生物学等级及监测[S].
[25] 国家药典委员会.《中国药典》[M].北京: 中国医药科技出版社, 2015.
[26] 俞永新. 中国乙型脑炎病毒株的毒力变异和减毒活疫苗的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2018, 32(5):449-457.
[27] World Health Organization.Global advisory committee on vaccine safety, 9-10 June 2005[J]. Wkly Epidemiol Rec, 2005, 80(28):242-247.
[28] WHO. Japanese encephalitis vaccines: WHO position paper, February 2015-recommendation[J]. Vaccine, 2016, 34(3):302-303.

小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立及在部分啮齿类动物的应用

Establishment of Real-time Fluorescent Quantitative PCR Method for Mouse Hepatitis Virus and Application in Some Rodents

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[1]	艾东旭, 孙菲, 李钰, 法云智, 孙兆增, 李莲瑞. 嗜肠型小鼠肝炎病毒RT-PCR诊断方法的建立及其应用[J]. 实验动物与比较医学, 2018, 38(1): 36-39.
[2]	周洁, 高诚, 胡建华. 小鼠肝炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 实验动物与比较医学, 2015, 35(1): 6-9.
[3]	韦姗姗, 杨合金, 屈会化, 赵琰, 王庆国. 常规实验操作对啮齿类动物应激系统的影响[J]. 实验动物与比较医学, 2014, 34(3): 255-258.
[4]	卫礼, 王吉, 付瑞, 李晓波, 王淑菁, 岳秉飞, 贺争鸣. 长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 实验动物与比较医学, 2013, 33(3): 204-209.
[5]	周洁1，宋宇2，姜浩3，胡建华1，高诚1. 小鼠肝炎病毒N蛋白基因在杆状病毒中的表达[J]. , 2010, 30(5): 317-317.
[6]	王吉，卫礼，岳秉飞，贺争鸣. ELISA方法检测抗体中两种显色系统的比较研究[J]. , 2010, 30(5): 368-371.
[7]	刘忠华, 黄韧, 魏社林, 刘香梅, 陈梅丽. 应用RT-PCR技术检测啮齿类动物冠状病毒[J]. , 2004, 24(4): 218-220.
[8]	邵伟娟, 高诚, 陈鸿书, 王胜昌, 包淳洋, 王晓明. RT-PCR方法在小鼠肝炎病毒检测中的应用[J]. , 2000, 20(3): 141-143.
[9]	高诚, 邵伟娟, 潘漪清, 王胜昌, 陈鸿书, 包淳洋, 王晓明. RT-PCR方法在小鼠肝炎病毒检测中的初步应用[J]. , 1999, 19(4): 207-209.
[10]	屈霞琴, 姜文琴, 钱琴应, 贤平, 潘振业, 陈天培. 生物素－链霉亲和素系统在检测MHV抗体中的应用[J]. , 1996, 16(3,4): 142-144.
[11]	王建飞，王晓明，邵伟娟. 小鼠肝炎病毒(MHV-1)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定[J]. , 1993, 13(1): 8-11.
[12]	李建平，屈霞琴，徐蓓，钱琴，沈菊阳，陈天培. 小鼠肝炎病毒多价抗体ELISA试剂盒研制[J]. , 1993, 13(1): 12-15.