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2019年 第39卷 第3期    刊出日期：2019-06-25

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基因修饰家兔研究进展

薛莹, 范江霖, 刘恩岐

2019, 39(3):  169-177.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.001

摘要 ( 353 )   PDF (621KB) ( 257 )  

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基因修饰(GM)家兔是生物医学研究极其重要的动物模型,过表达人类基因的家兔模型已经广泛用于人类心血管疾病、艾滋病和肿瘤等研究领域。到目前为止,制作转基因家兔模型绝大多数使用显微注射的方法,使外源基因随机插入到家兔基因组中。基于胚胎干细胞(ES细胞)的基因打靶技术是实现基因敲除(KO)、研究基因功能最有效的方法之一,然而,家兔缺乏稳定、可商业化使用的ES细胞系,所以利用ES细胞对家兔基因组进行编辑修饰是不可能实现的。近年来,新发展起来的以CRISPR-Cas9为代表的新的基因编辑技术,使得我们对家兔基因定点打靶突变和基因定点导入成为可能,并且利用这些技术已经成功培育了一批基因敲除家兔模型。基于我们的研究经历,本文简要回顾了GM家兔模型发展历史、研究进展以及在生物医学研究领域的应用。



论著

树鼩Mfsd2a基因的克隆分析和不同组织表达量的检测

王文广, 匡德宣, 李娜, 陆彩霞, 罕园园, 仝品芬, 孙晓梅, 代解杰

2019, 39(3):  178-186.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.002

摘要 ( 223 )   PDF (3404KB) ( 389 )  

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目的 对树鼩主要促进因子超家族成员2a(Mfsd2a)基因进行克隆、测序和生物信息学分析,并定量检测其组织表达量。方法 从树鼩脑和脊髓中提取总RNA,RT-PCR扩增Mfsd2a基因片段,测序后利用生物信息学软件对其序列特征、系统进化、编码蛋白的结构和理化性质进行分析; 以树鼩β-actin为内参,qPCR检测树鼩Mfsd2a基因在不同组织中的表达情况。结果 克隆获得Mfsd2a基因片段全长1 796 bp,与NCBI上公布的树鼩Mfsd2a基因预测序列高度一致,比对显示其与MFS转运蛋白超家族同源。其编码区全长1 464 bp,编码488个氨基酸。预测结果显示树鼩Mfsd2a蛋白具有明显的疏水性区域,无信号肽,二级结构元件由〈螺旋、β折叠、无规卷曲和延伸链组成。OCTOPUS分析发现Mfsd2a存在12个跨膜结构,修饰结构预测发现Mfsd2a 蛋白存在两处N糖基化位点,亚细胞定位发现其可能主要分布于细胞膜和内质网。qPCR检测树鼩不同组织的Mfsd2a表达,结果显示各组织均有表达,在大脑、脊髓中的表达水平相对较高。结论 成功克隆了树鼩Mfsd2a基因,建立了该基因表达定量检测方法,为今后利用树鼩神经系统疾病模型深入开展Mfsd2a基因功能研究提供了理论和技术支持。



新生乳兔右心室超负荷模型的初步构建和分析

丁雷, 王守宝, 荆辉, 李垚

2019, 39(3):  187-192.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.003

摘要 ( 250 )   PDF (1160KB) ( 273 )  

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目的 探讨构建新生乳兔右心室(RV)超负荷模型的方法,以便研究先天性心脏病患儿RV后负荷增加的病理生理重塑过程和机制。方法 选取出生当日乳兔30只,随机分为肺动脉环缩(PAB)组和假手术(Sham)组,每组各15只。PAB组于左侧第二、三肋间隙开胸,打开心包,暴露肺动脉,然后用6-0丝线环缩肺动脉; 除环缩步骤外,Sham组操作同PAB组。在术后14 d进行超声心动图检测以明确肺动脉的环缩程度,通过心导管检测RV收缩压和舒张压,尔后处死动物,取心脏组织行病理学检查,以评估两组动物心脏结构大体变化和右心室游离壁厚度。结果 环缩乳兔肺动脉可以显著增加RV后负荷。术后14 d时PAB乳兔存活率为80％,相对于Sham组, PAB组RV的收缩期峰值压力梯度、收缩压、舒张压和RV游离壁厚度均显著增加(P<0.01)。结论 通过新生乳兔PAB手术可成功构建RV超负荷模型。



Myh13敲除小鼠表型的初步分析

何一旻, 顾鸣敏

2019, 39(3):  193-200.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.004

摘要 ( 395 )   PDF (2103KB) ( 279 )  

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目的 对Myh13基因敲除小鼠模型进行初步的表型分析,探讨Myh13的生物学功能。方法 利用qRT-PCR和Western blotting技术检测小鼠中Myh13的表达情况; 采用基因测序、qRT-PCR和Western blotting法验证Myh13敲除小鼠; 统计杂合子小鼠自交产生的子代小鼠中各基因型比例; 观察小鼠体质量变化趋势,并检测血液生化指标; 对小鼠眼外肌进行HE染色和透射电子显微镜观察。结果 在小鼠模型中,Myh13特异性高表达于眼外肌组织。经DNA、RNA和蛋白水平验证,Myh13敲除小鼠中目的 基因成功剔除。杂合子小鼠子代中各基因型小鼠比例符合孟德尔遗传规律。Myh13敲除对小鼠的体质量、血生化指标无明显影响。HE染色结果提示,与野生型小鼠相比,杂合子和纯合子小鼠的眼外肌均无明显异常。电子显微镜下,杂合子和纯合子小鼠眼外肌中可见散在脂滴,并且纯合子小鼠还可见肌质网扩张的现象。结论 Myh13的敲除可改变小鼠眼外肌的微观结构,可能会影响眼外肌的功能。



循环内皮微粒相关microRNA在巨噬细胞炎性反应诱发小鼠动脉粥样硬化发生的机制

孙理华, 张颖, 曹桂秋, 李鹏, 胡强, 张雅玲, 幸世峰

2019, 39(3):  201-207.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.005

摘要 ( 256 )   PDF (1070KB) ( 282 )  

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目的 研究循环内皮微粒(EMPs)相关microRNA在巨噬细胞炎性反应诱发动脉粥样硬化(AS)发生的作用机制。方法 SPF级雄性ApoE^-/-小鼠206只,对照组50只,实验组随机分为动脉粥样硬化模型(AS模型)组、NC-miRNA 组和miRNA-19b抑制剂组,每组52只。采用油红染色对AS病变小鼠的组织学进行观察,计算斑块面积相对比例;检测生化指标的表达水平,主要包括小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG); ELISA检测血管炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-〈)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6和IL-10的变化; Western blot检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤因子(Bcl-2)、细胞凋亡的标志蛋白PARP降解产物(cleaved-PARP)和B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白(Bax)表达的变化, 实时荧光定量PCR检测miR-19b表达; 流式细胞法检测巨噬细胞的凋亡率。结果 miRNA-19b抑制剂组可减少由于AS引起的血管厚度增加,减少AS斑块面积比例; 使血脂中的TC、TG和LDL-C水平降低,HDL-C 水平则有升高; Bax、cleaved-PARP促相关的凋亡蛋白表达量下调,同时Bcl-2抗凋亡蛋白表达上调;血管中促炎症因子IL-1、IL-6和TNF-〈水平降低,抗炎症因子IL-10的水平则升高;同时使血管内巨噬细胞的凋亡率下降。结论 EMPs相关miRNA-19b的存在可以减少巨噬细胞的凋亡,并且通过上调促炎因子促进组织周围炎症的发生,进而促进AS的发展进程。



套环法和空气干燥法建立兔颈动脉粥样硬化斑块模型的比较分析

王琮, 陈筱雪, 杨少玲, 王凤翎, 范林艳, 贺倩倩

2019, 39(3):  208-212.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.006

摘要 ( 344 )   PDF (1119KB) ( 299 )  

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目的 比较颈动脉内膜空气干燥法及套环法建立兔粥样硬化斑块模型的优劣。方法 20只新西兰白兔随机分为空气干燥法组(A组)和套环法组(B组), 分别行颈动脉内膜空气干燥术及颈动脉外膜硅胶套环术, 术后高脂喂养。术后0周、4周、8周采用ELISA检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)浓度; 术后4周、8周、12周采用常规二维超声检查兔颈总动脉情况。术后12周完成超声检查后, 对2组兔颈总动脉斑块行HE染色, 病理学观察。结果 高脂饮食4周后血清TG、TC、LDL的浓度升高(P<0.05), 并持续升高, 而同一时间点A组与B组间上述指标未见明显差别; 高脂喂养8周后超声检查见2组兔的损伤段颈总动脉内中膜增厚, 管壁现斑块强回声; 病理学观察见大量泡沫细胞, 且套环组上述病变较空气组更早更显著。结论 颈总动脉套环法使兔颈总动脉在更短时间内出现部位明确预定的斑块, 安全性和有效性优于内膜空气干燥法。



B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞增殖、凋亡及迁移能力实验研究

景瑾, 张海骏, 杜利莉, 姬桂青, 邵义祥

2019, 39(3):  213-219.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.007

摘要 ( 271 )   PDF (1966KB) ( 368 )  

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目的 探讨B6-Co小鼠出生时眼睑闭合不全的形成机制。方法 分离、培养并鉴定B6-Co小鼠及其背景品系C57BL/6J(B6)眼睑成纤维细胞,CCK8法检测B6-Co、 B6小鼠眼睑成纤维细胞的增殖水平,Annexin V-FITC法检测B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平,Transwell检测B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的迁移能力。结果 成功培养出B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞,B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖能力和迁移能力极显著低于B6小鼠(P<0.01),B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡水平极显著高于B6小鼠(P<0.01)。结论 B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的增殖能力、凋亡水平及迁移能力均与B6小鼠有极显著差异。



小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性检测方法的建立

陈丽玲, 钟友宝, 刘漩, 陈来, 袁可望, 黄丽婷, 李姗姗

2019, 39(3):  220-225.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.008

摘要 ( 358 )   PDF (1171KB) ( 416 )  

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目的 在建立既能保留人肿瘤生物学特性的,且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动物模型的过程中,为保证小鼠脾淋巴细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的考察效率,摸索建立基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法。方法 用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人HepG2细胞,利用无水乙醇模拟杀伤人HepG2细胞,用碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪检测,确定CFSE 和PI 的浓度及作用时间。以小鼠脾细胞为效应细胞,人HepG2细胞为靶细胞,从效靶作用时间和效靶比方面进行优化,确定试验方法的最佳条件。结果 采用CFSE/PI 双标记将细胞分为CFSE⁺PI^-、CFSE⁺PI⁺、CFSE^-PI⁺和CFSE^-PI^- 4个组群,可有效区分活细胞和被杀伤细胞。CFSE 标记靶细胞的浓度采用2.5 µmol/mL,效靶作用时间为12 h,效靶比10∶1。结论 建立了基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法,该方法的建立可为评价动物脾淋巴细胞对异种细胞的杀伤作用提供参考。



应用于行为学研究中八臂迷宫实验方法的改良

刘波, 王杨, 李志杰

2019, 39(3):  226-230.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.009

摘要 ( 230 )   PDF (498KB) ( 291 )  

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目的 探讨一种简易有效的新型八臂迷宫实验方法。方法 选用20只雄性成年SD大鼠,分为传统方法组即对照组和改良电加热方法组即实验组,每组10只。于对照组食饵臂末端放置食饵,非食饵臂不放置食饵。实验组在非食饵臂末端放置加热装置作为错误惩罚外,其他条件与对照组相同。记录并比较实验大鼠于两种迷宫探索移动距离、时间、速度、进臂次数指标。结果 与对照组相比,实验组大鼠移动距离和探索时间明显缩短且进入错误臂次数明显减少。结论 使用改良电加热八臂迷宫实验方法能在训练7 d后更准确有效评估大鼠空间记忆学习能力,可作为一种有效的实验新方案。



用吖啶橙-流式细胞仪技术检测间苯二胺、对苯二胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率

陈秀娟, 江漪, 李敏, 李培宁, 孙侠, 陈梓灵, 丘智峰, 黄宇锋

2019, 39(3):  231-235.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.010

摘要 ( 260 )   PDF (1031KB) ( 335 )  

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目的 利用吖啶橙-单激光流式细胞仪(AO-FCM)检测间苯二胺(MPD)、对苯二胺(PPD)的小鼠骨髓细胞微核发生率,建立AO-FCM微核自动化检测方法,探讨FCM在化妆品原料致突变性检测中应用的可行性。方法 分别用剂量为25.0 mg/kg、12.5 mg/kg、6.25 mg/kg和3.12 mg/kg的MPD及PPD对小鼠进行处理。采用FCM检测小鼠骨髓中的嗜多染红细胞微核与传统显微镜检测的结果进行比较。结果 受试物组小鼠骨髓含微核的嗜多染红细胞数量均有相应的增多,且微核率均随着浓度的增加而增高,呈良好的量效关系。FCM与传统显微镜检测所得的微核率呈良好的相关性 (r =0.956, P<0.01 )。结论 FCM具有客观性、特异性、高效性,可代替传统显微镜用于检测化妆品原料对小鼠骨髓细胞微核的发生率,评价其致突变性。



经验交流

一例食蟹猴肠套叠诊断与治疗

李良顺, 潘世友, 支元芳, 白帅州, 孙建华, 宫丽崑, 任进

2019, 39(3):  236-238.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.011

摘要 ( 362 )   PDF (539KB) ( 256 )  

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长期毒性试验中,一只食蟹猴发生肠套叠,结合临床症状、血液生化指标检测、触诊和B超等方法确诊,采用体外按摩法复位套叠肠段,复位后采取补充能量、解痉、限食等护理措施,动物恢复良好,毒性试验如期进行。结果表明,触诊和B超相结合的方法,可准确诊断早期肠套叠; 采用体外按摩法可有效治疗早期肠套叠,且不影响长期毒性试验开展。



基于浏览器/服务器模式架构的高校动物实验管理系统开发与应用

徐孝平, 张利棕, 潘永明, 周卫民, 蔡月琴, 王德军

2019, 39(3):  239-243.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.012

摘要 ( 161 )   PDF (706KB) ( 235 )  

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高校实验动物中心每日会产生大量的业务数据,数据处理的效率直接体现了机构的管理水平和服务能力。本文简要介绍了浙江中医药大学动物实验研究中心动物实验管理系统的整体需求、总体架构、主要模块的操作流程和功能。系统开发结合了高校实验动物管理实际业务流程,实现了实验动物福利伦理审批、实验动物订购、动物实验申请、饲养管理以及费用结算等工作的计算机信息化管理。



综述

视网膜母细胞瘤斑马鱼模型及rb1基因研究进展

王俐梅, 张建, 刘忠华, 杨威

2019, 39(3):  244-248.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.013

摘要 ( 191 )   PDF (462KB) ( 273 )  

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视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是一种常见的发生于婴幼儿眼内的原发恶性肿瘤,大量的研究表明,rb1基因的改变是导致RB发生的主要原因。新型模式生物斑马鱼最近几年被开发成为研究RB的动物模型,本文在介绍rb1基因与RB疾病相关研究新进展的同时,综述了已有报道的RB斑马鱼模型建立方法,包括异种移植法、基因突变法和TALEN基因编辑法,并进一步将RB斑马鱼模型与已有报道的小鼠、大鼠、兔、非洲爪蟾RB动物模型进行了对比。

大鼠自发性及药物相关性胰岛纤维化研究进展

周飞, 王浩安

2019, 39(3):  249-252.  DOI: 10.3969/j.issn.1674-5817.2019.03.014

摘要 ( 175 )   PDF (313KB) ( 227 )  

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胰岛纤维化是大鼠常见的自发性疾病,随着年龄的增长,病变发生率逐渐升高,且雄性发生率高于雌性。该病的发病原因及机制目前尚未定论。许多药物也能引起或加重大鼠胰岛纤维化,胰岛血管损伤被认为与该病变的发生相关。本文综述了大鼠自发性及药物相关性胰岛纤维化的研究,为实验动物研究及毒性病理学家提供一定的参考。