实验动物与比较医学

大鼠肠系膜淋巴液持续引流新方法的初步建立

张笑瑞, 曹静, 吴倩倩, 康康, 陈国元, 吴宝金

2022, 42(4): 267-274. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.024

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目的通过建立大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流方法，实现肠系膜淋巴液的持续引流。方法将16只雄性SD大鼠随机均分为2组。对照组大鼠进行十二指肠和肠系膜淋巴管双插管手术，术后收集肠系膜淋巴液。实验组大鼠进行颈静脉和肠系膜淋巴管双插管手术，建立肠系膜淋巴管-颈静脉循环模型。术后第7天利用清醒活动装置收集肠系膜淋巴液，记录各组大鼠的肠系膜淋巴液流量，检测其细胞成分及部分生化指标。结果成功建立了大鼠肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流方法，模型维持时间达7 d以上。实验组大鼠的肠系膜淋巴液流量多于对照组流量［（2.01±0.12）mL/h vs（0.92±0.09）mL/h，P＜0.01］。实验组淋巴液中淋巴细胞数和淋巴细胞百分率高于对照组（P＜0.01，P＜0.05），而中性粒细胞比例和单核细胞比例均低于对照组（P＜0.01）。实验组淋巴液中K⁺、Na⁺、CO₂和尿素水平均高于对照组（P＜0.01），而三酰甘油和P³⁺水平均低于对照组（P＜0.01）。结论肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流技术能够实现大鼠在清醒、不限制饮食和正常活动状态下，实时并长期收集淋巴液，避免了手术应激、全身麻醉或动物受限对实验结果的影响。

不同剂型普罗布考对大鼠肠系膜淋巴转运及药代动力学的影响

张笑瑞, 曹静, 吴倩倩, 刘季俊, 陈国元, 吴宝金

2022, 42(4): 275-283. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.026

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目的通过一种新型的肠系膜淋巴管-颈静脉辅助回流模型，比较普罗布考橄榄油制剂与普罗布考混悬液制剂对大鼠肠系膜淋巴转运及药代动力学的影响。方法 12只SD大鼠随机分为4组，即混悬液制剂-颈静脉单插管组（H-JD组）、混悬液制剂-颈静脉和肠淋巴管双插管组（H-JCS组）、橄榄油制剂-颈静脉单插管组（G-JD组）、橄榄油制剂-颈静脉和肠淋巴管双插管组（G-JCS组）。用液相色谱和串联质谱联用（LC-MS/MS）法测定各组大鼠在不同时间全血和淋巴液中普罗布考的浓度，绘制药-时曲线，计算药代动力学参数、相对生物利用度（F_rel）和淋巴液剂量百分比。结果各组的药-时曲线符合非房室模型。前述各组到达峰值时间（T_max）分别为（11±12）h、（5±2）h、（13±9）h和（19±9）h；到达峰值浓度（C_max）分别为（148±60）ng/mL、（207±137）ng/mL、（453±204）ng/mL和（309±177）ng/mL；药-时曲线下面积（AUC_last）分别为（3 210±885）h·ng·mL^-1、（3 677±2 014）h·ng·mL^-1、（12 360±6 629）h·ng·mL^-1和（8 080±3 064）h·ng·mL^-1。H-JCS组和G-JCS组的淋巴液剂量百分比分别为（1.29±0.50）%和（2.59±0.43）%。与H-JD组相比，G-JD组中普罗布考的F_rel为（409±269）%；与H-JCS组相比，G-JCS组中普罗布考的F_rel为（309±256）%。与H-JD组和H-JCS组相比，G-JD组和G-JCS组大鼠全血的C_max、T_max、AUC_last和淋巴液剂量百分比显著升高（P＜0.05）；其中G-JD组全血的AUC_last显著高于G-JCS组（P＜0.05），而H-JD组和H-JCS组差异无统计学意义（P > 0.05）。结论使用橄榄油制剂可以提高普罗布考通过肠系膜淋巴液的转运吸收率和生物利用度。

三硝基苯磺酸诱导急性肠纤维化大鼠模型的改良方法

王怡如, 蒋笑影, 董若曦, 潘一滨, 韩向晖, 曹永清

2022, 42(4): 284-293. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.147

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目的探索2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）诱导急性肠纤维化大鼠模型的方法及不同药物配比的效果。方法 30只雌性SD大鼠随机分为5组，每组各6只。A～D组为模型组，模型组大鼠采用不同配比的药物溶液通过改良保留灌肠法一次性造模：A组，5%TNBS+ 50%乙醇（体积比1∶1）；B组，5%TNBS+ 75%乙醇（体积比1∶1）；C组，5%TNBS+ 100%乙醇（体积比1∶1）；D组，5%TNBS+ 50%乙醇（体积比2∶1）；对照组用生理盐水（0.9%氯化钠溶液）灌肠；观察造模后1周内动物的症状、体征和体质量变化，并进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分。分别于造模后7 d和14 d，随机选择每组内一半大鼠进行取材，观察结肠组织大体损伤程度并以结肠炎损伤指数（colon macroscopic damage index，CMDI）评分；结肠组织病理切片以HE染色观察肠炎严重程度，Masson染色观察胶原纤维沉积情况。结果各模型组大鼠均出现轻重不等的肠炎及肠纤维化病变，其中以体积比为1∶1的5%TNBS+75%乙醇溶液造模观察期内未导致大鼠死亡，造模后24 h大鼠体质量明显下降、出现稀便及血便症状，结肠壁纤维化病变明显，体质量下降、DAI评分与CDMI评分升高，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；光学显微镜下炎症程度较重，呈透壁性；Masson染色显示造模部位的肠壁增厚明显，黏膜下层、肌层及浆膜层均出现弥漫性胶原纤维沉积。结论改良的TNBS保留灌肠法能有效构建肠纤维化大鼠模型，体积比为1∶1的5%TNBS+75%乙醇溶液所建模型可模拟克罗恩病纤维化两大特征，即透壁性炎症和肠壁纤维化。该造模方法简便、高效，动物死亡率低。

利用CRISPR/Cas9技术构建脂多糖结合蛋白基因敲除小鼠

李思迪, 付彬, 郭中坤, 林颖杰, 张振宇, 米传靓, 王可洲

2022, 42(4): 294-300. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.002

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目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相关蛋白核酸酶9（CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）基因编辑技术构建稳定遗传的脂多糖结合蛋白（lipopolysaccaride binding protein，Lbp）基因敲除小鼠。方法根据C57BL/6J小鼠的Lbp基因序列特征，设计sgRNA靶点，删除Lbp基因5’-端蛋白编码保守序列并引入移码突变，使编码LBP失活。提取F0、F1、F2、F3代小鼠基因组，PCR鉴定并测序验证Lbp基因敲除效果，RT-PCR测序验证Lbp基因转录水平，蛋白质印迹法验证F2代LBP蛋白表达水平。结果 F0代获得5只杂合子敲除小鼠（Lbp^+/-）、F1代获得3只Lbp^+/-小鼠，F2代获得4只Lbp纯合子敲除小鼠（Lbp^-/-），F3代获得30只Lbp^-/-小鼠。RT-PCR测序表明，Lbp^-/-小鼠mRNA缺失244 bp且发生移码突变，导致翻译提前终止。蛋白质印迹证明Lbp^-/-小鼠肝脏组织中无LBP蛋白表达。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建可以稳定遗传的Lbp基因敲除小鼠，为后续进一步研究LBP的免疫及其生理作用提供基础。

放置时间对大鼠血清样本中电解质含量及pH值的影响

冯丁山, 黄业宇, 张晓昕, 吴爱琴, 王湛, 苏林梁

2022, 42(4): 301-305. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.023

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目的观察SD大鼠血清样本放置时间对血清中K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cl^-含量和pH值检测结果的影响。方法取雌雄SD大鼠各20只，腹腔静脉采血后分离血清，样本加盖存放于2～8 ℃，在0 h、2 h、4 h、6 h、24 h、48 h和120 h共7个时间点分别测定K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cl^-含量和pH值。结果 K⁺、Na⁺含量各时间点比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与0 h检测结果比较，放置48 h和120 h的Cl^-含量明显升高（P＜0.05），放置48 h和120 h的Ca²⁺含量明显降低（P＜0.05），放置24 h、48 h、120 h的pH值明显升高（P＜0.05）；而在6 h内这3个指标均无明显差异（P＞0.05）。结论 SD大鼠血清样本放置时间对血清中Ca²⁺、Cl^-、pH检测结果有明显影响，样本应加盖贮存于2～8 ℃，并在6 h内完成检测。

浅谈微量采血法在药物非临床研究中的应用及3R原则的贯彻

陈佳琦, 吕龙宝, 张飞燕, 李瑞, 李乙江, 李丽红, 张晓迪

2022, 42(4): 306-312. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.163

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药物开发中的实验动物福利伦理备受关注，如何善待动物已成为一个重要课题。微量采血法（blood microsampling）克服了常规大容量采血方法操作复杂、对动物的伤害大、对啮齿类动物的数量要求高等诸多缺点，在动物福利、科学性和成本方面均有极大优势，其应用被认为是落实3R原则的重要实践。本文介绍微量采血法的最新研究进展以及在非临床研究中应用的优势和挑战，以期推动这项新技术在药物开发领域内更广泛应用。

皮肤致敏性替代试验方法的研究进展

黄静怡, 李培宁, 刘香梅, 刘忠华, 黄宇锋

2022, 42(4): 313-321. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.173

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过敏性接触性皮炎是皮肤反复接触某种物质后所引起的Ⅳ型超敏反应，也是常见的公共健康问题。传统皮肤致敏性测试以豚鼠最大值试验、封闭斑贴等动物实验为主。近年来，随着动物伦理不断被人们重视以及科学技术的发展，皮肤致敏试验替代方法相继出现。根据原理不同，这些替代方法分为体内替代法、几类基于有害结局通路的体外替代法、基因组过敏原快速检测法等。本文将对这些皮肤致敏试验替代方法的研究进展以及几类基于有害结局通路的整合测试与评估方法进行综述。

抑制磷脂酶D1活性可促进缺血性脑卒中模型小鼠神经功能恢复

朱彦兵, 白帆, 陶少鑫, 潘雨花蕾, 王欢, 赵羽商, 王崧, 于艳

2022, 42(4): 322-332. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.041

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目的探讨小鼠缺血性脑卒中发生后不同时期病灶脑组织自噬的动态变化，以及抑制磷脂酶D（phospholipase D，PLD）1活性与自噬及神经功能的关系。方法先用21只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠构建缺血性脑卒中模型，随机分为假手术组和缺血性脑卒中后4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、72 h组，每组各3只，采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测小鼠病灶脑组织中自噬相关蛋白LC3的表达及分布情况。另将36只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中后腹腔注射PBS组和4个浓度（0.3、0.9、1.8和3.6 mg/kg）的PLD活性抑制剂FIPI组，每组各6只；缺血性脑卒中发生后的第1、第3和第7天，分别通过贴纸去除实验、触须诱发前肢放置实验和TTC染色法评估抑制剂最佳浓度及其对神经功能和脑梗死面积的影响。再将9只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中后立即腹腔注射PBS和0.9 mg/kg FIPI组，每组3只，通过蛋白质印迹法检测FIPI对自噬相关蛋白表达的影响。最后将36只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中后立即腹腔注射PBS组以及不同时间窗（术后立即和术后4 h、8 h、12 h）腹腔注射0.9 mg/kg FIPI组，每组各6只，通过行为学实验和TTC染色法评估缺血性脑卒中小鼠的神经功能和脑梗死面积。结果小鼠缺血性脑卒中发生后，病灶组织中LC3-Ⅱ相对表达水平开始升高，24 h达到峰值（P＜0.05），然后逐渐下降。与PBS组相比，给予0.9 mg/kg的 PLD1活性抑制剂FIPI组能明显抑制小鼠缺血性脑卒中后病灶组织中LC3-Ⅱ相对表达水平（P＜0.05），缩小梗死面积（P＜0.05），促进损伤后神经功能的恢复（P＜0.05）。与PBS组相比，除了缺血性脑卒中后立即给予FIPI组外，缺血性脑卒中后4 h、8 h和12 h腹腔给予FIPI也都可以明显缩小梗死面积（P＜0.05），使小鼠神经功能得到明显恢复（P＜0.05）。结论缺血性脑卒中发生后24 h病灶组织自噬最为明显，降低PLD1活性可以明显抑制自噬，从而促进缺血性脑卒中后神经功能的恢复。同时，除了缺血性脑卒中后立即给予FIPI外，延迟4～12 h给予FIPI也可以缩小梗死面积，促进神经功能的恢复，这拓宽了缺血性脑卒中的治疗窗口期，可能为临床治疗脑卒中提供新的策略。

大鼠急性牙髓炎痛敏模型的疼痛效应评价

赵斯佳, 何新宇, 景泉, 马林, 郭春岚, 万阔

2022, 42(4): 333-341. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.171

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目的采用大鼠上颌磨牙开髓暂封脂多糖处理的方法诱导急性牙髓炎模型，并对造模后大鼠出现的急性疼痛和牙髓炎症状态进行分析和评价，探究急性牙髓炎模型大鼠的痛阈改变。方法将45只成年雄性SD大鼠分为脂多糖（LPS）组、生理盐水（NS）组和空白对照（SHAM）组，每组15只。LPS组大鼠右上第一磨牙开髓后暂封LPS，制备大鼠急性牙髓炎模型；NS组开髓暂封生理盐水；SHAM组仅进行诱导麻醉。在造模前及造模后的2 h、24 h、48 h和72 h，分别检测3组大鼠的疼痛行为学指标，包括自发性疼痛行为评分、足机械刺激后的50%缩足反射阈值（paw withdrawal threshold，PWT）、舌机械刺激后的头部退缩反射阈值（head withdrawal threshold，HWT）、冷刺激后的缩足反射潜伏期（paw withdrawal latency，PWL）以及牙齿冷刺激后的头部退缩反射潜伏期（head withdrawal latency，HWL）；麻醉处死大鼠后，HE染色观察牙髓组织病理学变化，ELISA法测定大鼠血清中白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。结果在自发性疼痛行为方面，造模后LPS组大鼠面部梳理时间明显多于NS组（P＜0.05），且随造模后时间延长而不断增加，而大鼠活动时间未见明显差异。在机械痛敏方面，造模后2 h、24 h及48 h的LPS组HWT明显低于NS组（P＜0.05）；LPS组和NS组大鼠的50% PWT分别较SHAM组明显降低（P＜0.05），但LPS组与NS组间未见明显差异。在冷刺激痛敏方面，LPS组较NS组大鼠的HWL在造模后2 h和48 h明显降低（P＜0.05）；造模后72 h，LPS组的PWL较NS组明显降低（P＜0.05）。LPS及NS组大鼠血清中IL-1β和TNF-α水平在造模后2 h开始升高，并于48 h达到峰值，组间差异明显（P＜0.01或P＜0.05）。病理学结果显示，自造模后24 h至72 h，LPS组中性粒细胞浸润区逐渐由穿髓点依次扩大至冠髓及上段根髓，NS组较LPS组的炎症表现程度较轻。结论基于大鼠行为学观察、牙髓病理学特征改变及血清炎性因子检测，LPS诱导急性牙髓炎模型可导致大鼠出现病理性疼痛和痛阈改变。

阿尔茨海默病动物模型的研究进展

盛哲津, 李利妹

2022, 42(4): 342-350. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.122

摘要 ( 445 )

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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是最常见的老年性神经退行性疾病之一，严重威胁着老年人的健康。目前被批准用于治疗AD的药物只能缓解AD的症状，不能治愈AD或阻止其恶化。近40年来，虽然AD的治疗方法层出不穷，包括阻止脑淀粉样蛋白沉积或清除已有淀粉样蛋白斑块的化合物，但是它们的临床疗效并不显著。因此，需要更多的基础和临床研究来深入探讨AD疾病生物学机制。实验动物模型不仅对AD发病机制的研究，还对AD药物的开发都非常重要。本综述从AD病理组织学特征和遗传因素出发，论述已有的AD动物模型以及其评价方法。

动物模型在Eph家族蛋白功能研究中的应用

胡耀华, 赵菊梅, 师长宏

2022, 42(4): 351-357. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.010

摘要 ( 257 )

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促红细胞生成素产生肝细胞激酶（erythropoietin-producing hepatocyte kinase，Eph）作为家族成员最多的受体酪氨酸激酶，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，具有广泛的临床应用价值。动物模型在探索Eph家族分子的生物学功能、分子机制以及筛选治疗靶点等方面发挥了重要作用。本文总结归纳了异种移植瘤模型、肿瘤免疫治疗模型以及基因修饰模型在Eph家族功能研究中的应用及最新研究进展，总结了各类模型的优缺点，以期为研究者开展Eph相关研究时选择合适的动物模型提供参考。

实验动物质量控制中泰泽病原体的研究进展

陶俊豪, 鄢慧琼, 谢珲, 应华忠, 戴方伟

2022, 42(4): 358-363. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.166

摘要 ( 689 )

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泰泽病原体（Tyzzer’s organism）是一种能引起实验动物肝肠坏死和腹泻的毛发状芽孢杆菌（Clostridium piliforme，旧称Bacillus piliformis）。该病原体引起的泰泽病是一种急性疾病，其发病迅速、致死率高、临床症状不明显，往往难以进行早期诊断和治疗，一旦爆发，将会造成严重的经济损失和实验室安全问题。本文从泰泽病原体的生物学特性、流行病学与疾病特征、检测方法、研究进展及防治多个方面进行综述。

高校ABSL-2实验室流程管理的实践探讨：以厦门大学为例

郑秀青, 邵志强, 宋婧, 张越华, 苏金华

2022, 42(4): 364-370. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2021.160

摘要 ( 420 )

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建立标准化、科学化、规范化的动物生物安全二级（animal biosafety level-2，ABSL-2）实验室是支持高校涉及病原微生物教学和科研工作顺利开展的重要保证。本文以厦门大学实验动物中心ABSL-2实验室为例，分别从资质备案，生物安全管理体系文件，日常工作管理，压力梯度控制，人员、动物及物品的管理，生物安全监督检查，以及废弃物处理等方面，详细阐述了ABSL-2实验室的运行及管理模式，并针对管理过程中遇到的问题提出应对措施。

中国生育调节药物毒理检测中心实验动物研发平台

2022, 42(4): 371-372. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.113

摘要 ( 174 )

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复旦大学丁玉强实验室及实验动物科学部

2022, 42(4): 373-374. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.115

摘要 ( 258 )

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树鼩种质资源中心/代解杰实验室

2022, 42(4): 375-376. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2022.114

摘要 ( 165 )

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