成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究

›› 2010, Vol. 30 ›› Issue (4): 233-240.

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成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究

1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐，830052；2.新疆医科大学一附院医学研究中心新疆包虫病基础医学重点实验室，乌鲁木齐，830052；3.上海交通大学医学院实验动物科学部，上海，200025；4.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040

收稿日期:2010-01-12 出版日期:2010-04-30 发布日期:2010-04-30
基金资助:
国家自然科学基金（30770324）；上海市科委基础研究重点项目（08JC1413900）和上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2006）第5-3号）；上海市重点学科建设项目（S30201）；上海市科委资助（No.09140901000）

The Targeting Study of Rabbit HGPRT Gene

1.College of Animal Medicine of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;2.Medical Research Center and Xinjiang Key Lab on Echinococcosis, 1st Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China; 3. Department of Laboratory Animal Science,School of Medicine, Shanghai JiaoTong University，Shanghai 200025，China;4. College of Wildlife Resoure of Northeast Forestry University, Harbin 120040, China

Received:2010-01-12 Online:2010-04-30 Published:2010-04-30

摘要/Abstract

摘要： 目的构建兔HPRT基因打靶载体。方法在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）基因BAC克隆（LBNL1304M19）的基础上，利用Red重组系统，从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上，产生pKS-HGPRT质粒。然后基于pKS-HGPRT和pEGFP-C1-SD1211质粒，构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）及新霉素（neo）筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-neo.结果将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中，利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选，共得到抗性细胞克隆20个。对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定，获得8个发生同源重组的细胞克隆，还需利用Southern blotting做进一步验证。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除型打靶载体，为下一步进行体细胞核移植制备HGPRT基因敲除转基因克隆兔奠定基础。

关键词: 基因敲除, 兔成纤维体细胞, 次黄嘌吟-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶, 细胞筛选

Abstract: Objective To construct a rabbit HPRT gene targeting vector. Methods The rabbit full length HGPRT gene BAC clone LBNL1-304M19 is used as the template. A 12.5kb rabbit HGPRT gene fragment, which does not include promoter，is cloned into pKS- plasmid to form pKS-HGPRT recombi-nant plasmid via Gap-Repair by Red recombination system. Then we construct a GFP and neo selective targeting vector pKS-HGPRT-GFP-neo on the basis of pKS-HGPRT and pEGFP-Cl-SD1211 plasmids.Results Linearized targeting construct DNA was introduced into the rabbit fibroblasts by Lipofectamine^TM 2000. The positive-negative selection was performed and survival clones were screened by PCR and sequencing, and eight colonies with homologous recombination were obtained. The targeted colonies would further confirmed by Southern blotting. Constructions The knockout HPRT targeting vector was rapidly constructed and the results set a good basis for the establishment of HGPRT-knockout rabbit by gene target and nuclear transfer methods.

Key words: Knockout, Rabbit fibroblast, HGPRT, Cell isolation

王伟1，张传山2，郭毅3，谷瑞环3，丁雷4，姚刚1，陈学进3. 成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究[J]. , 2010, 30(4): 233-240.

WANG Wei1，ZHANG Chuan-shan2，GUO Yi3，GU Rui-huan3，DING Lei4，YAO Gang1，CHEN Xue-jin3. The Targeting Study of Rabbit HGPRT Gene[J]. , 2010, 30(4): 233-240.

[1]	刘甦苏, 吴勇, 曹愿, 赵皓阳, 翟世杰, 孙晓炜, 李琳丽, 范昌发. hKDR^+/+ 人源化及Rag1^-/-基因缺陷新型双靶点遗传修饰荷瘤小鼠模型的建立[J]. 实验动物与比较医学, 2023, 43(2): 103-111.
[2]	李思迪, 付彬, 郭中坤, 林颖杰, 张振宇, 米传靓, 王可洲. 利用CRISPR/Cas9技术构建脂多糖结合蛋白基因敲除小鼠[J]. 实验动物与比较医学, 2022, 42(4): 294-300.
[3]	胡宇, 兰昀羲, 陈晓晓, 熊伟, 唐宋琪, 贾波, 黄巍. 溃疡性结肠炎动物模型研究进展[J]. 实验动物与比较医学, 2022, 42(3): 220-228.
[4]	洪胜辉, 张旭亮, 王芊芊, 刘平, 刘迪文. 抑制素基因敲除小鼠模型的构建及表型初步分析[J]. 实验动物与比较医学, 2020, 40(4): 306-.
[5]	高梦樵, 艾东旭, 李钰, 孙菲, 王进, 范君文, 袁征, 刘源, 孙兆增. 利用CRISPR/Cas9技术构建环指蛋白126基因敲除小鼠[J]. 实验动物与比较医学, 2019, 39(1): 21-25.
[6]	艾东旭, 钟德刚, 孙菲, 李钰, 李崇, 秦佟童, 高梦樵, 董施施, 孙兆增, 李莲瑞. 利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠[J]. 实验动物与比较医学, 2018, 38(3): 202-206.
[7]	郑欣洵, 张智静, 黄宝艺, 廖子君, 刘建军, 罗涛. 单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ条件敲除小鼠的繁殖和基因型鉴定[J]. 实验动物与比较医学, 2018, 38(3): 222-226.
[8]	池骏, 龚慧, 何玥炜, 万颖寒, 费俭, 匡颖. 瘦素基因敲除小鼠模型的建立及表型分析[J]. 实验动物与比较医学, 2017, 37(5): 344-351.
[9]	杨葳, 周生来, 董婉维, 王惟, 于洋, 郭晓冲, 张婀娜, 王宏宇, 郑志红. eNOS基因敲除大鼠模型的建立及表型初步研究[J]. 实验动物与比较医学, 2015, 35(4): 271-276.
[10]	徐影琪, 李晓晶, 杨葳, 周生来, 于洋, 王惟, 张婀娜, 赵文, 张梅英, 郭大勇, 王宏宇, 郑志红. 应用Talen法制备apoE基因敲除大鼠模型[J]. 实验动物与比较医学, 2015, 35(4): 277-282.
[11]	孙敏, 沙海波, 屠鑫, 邹耩欢, 赖贝贝, 高翔, 齐心. Hnrnpu^+/-小鼠表现出发育迟缓、活动水平下降和糖代谢异常[J]. 实验动物与比较医学, 2015, 35(3): 175-181.
[12]	姜伟华, 李善刚, 陈学进. ApoE基因功能及相关疾病模型的研究进展[J]. 实验动物与比较医学, 2015, 35(3): 249-257.
[13]	罗肖, 魏双羽, 贾如, 姚婷, 张燕茹, 师小博, 闫剑群. BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鉴定[J]. 实验动物与比较医学, 2014, 34(5): 381-385.
[14]	周炜, 张迪, 于卓, 查巍巍, 冯立新. 精原干细胞中Pten基因敲除小鼠模型的建立及初步的表型分析[J]. 实验动物与比较医学, 2014, 34(1): 1-5.
[15]	陈锡文，陈通克，王一龙，管敏强，林蓓蓓. ALK3/α-MHC基因敲除小鼠部分生物学特性的观测[J]. , 2009, 29(4): 254-256.

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