急性肺损伤是一种以肺部急性炎症和肺泡-毛细血管屏障通透性增高为特征的临床综合征。作为急性呼吸窘迫综合征的早期阶段，急性肺损伤常导致呼吸功能急剧恶化，其主要病理特征为肺泡上皮和毛细血管内皮损伤、过度炎症反应及肺水肿^［1-2］。清肺排毒汤（Qingfei Paidu decoction，QFPDD）作为中医药抗击新型冠状病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）的核心方剂，具有祛寒湿、祛热浊、升肺补脾、解毒祛病的功效^［3-4］。临床与基础研究表明，QFPDD可通过调节免疫平衡、抑制炎症因子风暴、减轻肺组织病理损伤等途径改善呼吸系统疾病症状^［5-7］。

miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的、具有调控功能的非编码 RNA，其长度约18～24个核苷酸^［8-9］。miRNA在动物体内的主要作用是通过与靶mRNA的3'非翻译区碱基互补配对，抑制该mRNA的蛋白质翻译或直接介导其降解。这种结合主要基于不完全互补，既能阻断核糖体的翻译过程，也能促进mRNA进入降解途径^［10-11］。越来越多的研究显示，miRNA在免疫反应中具有调节作用，包括调节免疫细胞的发育、分化和炎性介质的释放等^［12-13］。本研究采用高通量测序技术，从miRNA分子层面探索 QFPDD对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠急性肺损伤的作用机制。

24只4周龄SPF级雄性KM小鼠（体重18～22 g）由江西中医药大学实验动物科技中心［SCXK（赣）2023-0001］提供，实验动物质量合格证号为No.0002974。动物饲养于江西中医药大学实验动物科技中心［SYXK（赣）2022-0002］，饲养环境温度为21～23 ℃，相对湿度40%～50%，12 h/12 h明暗交替，动物自由摄食和饮水。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC20241017）。

QFPDD的方剂组成和用量包括麻黄9 g、炙甘草6 g、杏仁9 g、生石膏30 g、桂枝9 g、泽泻9 g、猪苓9 g、白术9 g、茯苓15 g、柴胡16 g、黄芩6 g、姜半夏9 g、生姜9 g、紫菀9 g、冬花9 g、射干9 g、细辛6 g、山药12 g、枳实6 g、陈皮6 g、藿香9 g，均购自江西中医药大学附属医院。依据《新型冠状病毒感染诊疗方案（试行第十版）》中的推荐用量，称取一副剂量的各类药材。将纱布包裹的生石膏粉末（30 g）单独置于烧杯中，加水浸没至超出1～2 cm，浸泡45 min；其余药材碾碎后置于烧杯中（共计181 g），加水浸没药材至超出1～2 cm，浸泡30 min。一煎时，生石膏先煎15 min，后放其他药材，武火加热煮沸，随后转文火慢煎20 min，药液经100目药典筛（6号筛）过滤至烧杯中；二煎时，向药渣中加水浸没药材至超出1～2 cm，武火煮沸，转文火慢煎15 min，过筛，两次煎出的药液经合并后浓缩（旋转蒸发仪60 ℃）至132 mL，获得QFPDD浓缩液。

LPS（批号0000223034）和戊巴比妥钠（批号1014P035）均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。小鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、小鼠白细胞介素（interleukin，IL）-1β和小鼠IL-6检测用ELISA试剂盒（批号202411）均购自上海赫澎生物科技有限公司。HE染色液（批号20240301）购自南昌雨露实验器材有限公司。TRIzol试剂（批号10533471）购自美国Invitrogen公司。miRNA cDNA合成试剂盒（批号7E3192E5）和miRNA SYBR Green实时荧光定量PCR预混液（批号7F128214）均购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。

测序平台（Illumina HiSeq 2500）购自美国Illumina公司；脱水机（Leica HistoCore PEARL）、包埋机（Leica Arcadia）、全自动病理染色机（Leica ST5010）和显微镜（Leica DM2500B）均购自德国Leica公司；高速冷冻离心机（Beckman Allegra 64R）购自美国Beckman Coulter公司；超高通量核酸分析仪系统（Agilent 5400）购自美国Agilent公司；荧光定量PCR仪（Roche LightCycler 96）购自瑞士Roche公司。

按体重随机分层方法将24只KM小鼠分为对照组、模型组和QFPDD组，每组8只。适应性饲养1周后，对照组和模型组以超纯水（0.2 mL/次，2 次/d）连续灌胃8 d；QFPDD组以QFPDD汤剂（生药1.6 g/mL，0.2 mL/次，2 次/d，小鼠等效剂量为32 g·kg^-1·d^-1）连续灌胃8 d。从灌胃开始计第1天，每天内2次灌胃给药均间隔6 h。从第2天至第8天，模型组与QFPDD组用4 mL LPS溶液（2.5 g/L）进行雾化处理（持续置于原雾化箱中饲养），90 min/次，1 次/d，连续7 d。

在灌胃给药开始的第1和第9天，分别称量所有小鼠体重，记为初始体重与终末体重。第9天称重后，用1%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠，给药剂量为5 μL/g。深度麻醉后，先经眼底静脉丛采血，再取每只小鼠的完整肺组织，用生理盐水冲洗后，用滤纸吸干表面液体，称重并计算肺系数。肺系数=肺组织质量/小鼠体重×100%，该系数值越大，表示小鼠肺组织相对增重越明显，提示肺部炎症或水肿等病理改变越严重。

取1.5节采集的眼底静脉丛血液约0.5～0.8 mL，室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min，取血清于-80 ℃保存备用。用ELISA试剂盒检测所有小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的含量，每份样本设3个复孔，严格按试剂盒说明书操作。

取每组各4只小鼠的左肺下叶，置入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，用全自动病理染色机脱蜡后行HE染色，切片厚度4 μm，封片后用光学显微镜观察肺组织病理学改变。

从各组随机选取4只小鼠的肺组织，用TRIzol试剂提取总RNA。用Agilent 5400超高通量核酸分析仪检测RNA，合格的RNA样本（总质量达到1 μg以上，RNA完整值≥7，有明显的28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA峰）用于后续miRNA测序及实时荧光定量PCR验证。

miRNA文库构建步骤如下：总RNA先后连接3'和5'接头，经反转录合成cDNA，再进行PCR扩增；扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，切取约147～157 bp目标条带并纯化；可选80%乙醇溶液沉淀以提高文库浓度；最后用5400片段分析仪检测文库质量，按标准流程进行变性处理，并于Illumina平台进行测序。

采用ACGT101-miR（v4.2）流程分析miRNA测序数据，步骤如下：原始数据经去接头、去低质量序列及rRNA/tRNA等非编码RNA过滤后，获得18～26 nt的有效序列（clean reads）。将其比对至miRBase 22.1以鉴定已知miRNA，未匹配序列通过比对参考基因组，并利用RNAfold预测发夹结构，依据11项标准（如茎区配对≥16 bp、自由能≤-15 kcal/mol等）鉴定新miRNA。基于标准化表达量，使用t检验（有生物学重复）或Fisher精确检验（无重复）分析差异表达miRNA。miRNA差异表达分析的输入数据为归一化后的数据，以|Fold change|＞1且P＜0.05为阈值，获得差异表达miRNA。

利用TargetScan和Miranda软件预测miRNA靶基因，并进行基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。RNA提取、建库和测序工作均由杭州联川生物技术有限公司负责执行。

筛选出差异表达的miRNA后，根据这些miRNA与其靶基因的关联性，深入分析每组相关的靶基因。利用GO数据库与KEGG数据库对miRNA靶基因进行富集分析。以P＜0.05为显著性阈值，筛选出候选靶基因显著富集的GO功能条目及KEGG信号通路。

以总RNA为模板，使用miRNA第一链cDNA合成（茎环法）试剂盒合成miRNA的cDNA产物，反应条件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。通过实时荧光定量PCR检测差异表达miRNA，反应条件：95 ℃ 预变性5 min，95℃ 变性10 s，58 ℃退火/延伸30 s，循环40次。以U6作为内参，以2^-ΔΔCt 法计算相对表达水平。U6反转录引物序列为5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'，PCR正向引物序列为5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'，PCR反向引物序列为5'-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3'。mmu-miR-203-3p反转录引物序列为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACCTAGTG-3'，PCR正向引物序列为5'- CGCGGTGAAATGTTTAGGAC-3'，PCR反向引物序列为5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。PCR验证用肺组织来自每组4只小鼠，每个样本重复3次。

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据用x̄±s表示，在方差齐性条件下采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

灌胃给药前，各组小鼠的初始体重差异无统计学意义（P＞0.05），说明实验前各组动物基线水平一致，组间具有可比性；灌胃给药8 d实验结束后，各组小鼠的终末体重与初始体重相比均呈增长趋势，且各组间终末体重差异无统计学意义（P＞0.05），提示LPS建模及药物干预未对小鼠的整体生长状态造成显著影响。结果见表1。

与对照组相比，模型组小鼠的肺系数升高（P＜0.01），提示模型组小鼠可能出现肺充血或水肿。与模型组相比，QFPDD组小鼠肺系数下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示QFPDD对急性肺损伤小鼠肺水肿可能具有一定的改善作用。

ELISA结果显示，各指标的标准曲线均线性良好（R²＞0.99），试剂盒配套阳性对照和阴性对照的测定值均在说明书规定的质控范围内。与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，QFPDD组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）；而IL-1β在各组间差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）。

HE染色结果如图1所示，对照组小鼠肺组织呈正常结构；模型组小鼠肺组织肺泡间隔增宽，有大量炎症细胞浸润，部分肺泡扩张、融合，少量毛细血管扩张、淤血；与模型组相比，QFPDD组小鼠肺组织肺泡间隔稍增宽，仅有少量炎症细胞浸润。

miRNA测序结果显示，从小鼠肺组织中共鉴定出1 078个miRNA。差异表达分析发现，模型组与对照组之间有82个差异表达miRNA（P＜0.05），QFPDD组与模型组之间有79个差异表达miRNA（P＜0.05）（图2A）。交集分析显示，有13个miRNA在两次比较中均存在显著差异。值得注意的是，其中6个miRNA（mm u-miR-203-3p、mmu-miR-181b-5p、hsa-miR-4286、mmu-miR-1843b-5p、mmu-miR-22-3p和mmu-miR-1964-3p）在模型组中的表达量较对照组显著上调，且在QFPDD治疗后显著下调，提示其可能与QFPDD的治疗效应相关（图2B）。

利用GO数据库对差异表达miRNA的靶基因（mRNA）进行功能富集分析，筛选出P值最小的前5个条目，包括生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function），如图3所示。与模型组相比，QFPDD组小鼠肺组织差异表达miRNA的靶基因富集的生物学过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ对转录的调控、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调控，以及DNA模板转录的正向调控等；细胞组成方面，主要涉及质膜、细胞核和细胞质等；分子功能方面，主要涉及蛋白质结合、金属离子结合和转移酶活性等。

利用KEGG数据库对miRNA的靶基因所涉及的信号通路进行富集分析，结果如图4A所示。与模型组相比，QFPDD组小鼠肺组织中差异表达miRNA的靶基因主要富集于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路和癌症相关通路等。进一步将差异表达miRNA的靶基因定位到MAPK信号通路，按“单个miRNA对应的靶基因富集到MAPK信号通路的数量”由多到少排序，最终筛选出排序前20的miRNA如图4B所示。在上述排名前20的miRNA中，mmu-miR-203-3p和mmu-miR-22-3p与前期筛选得到的6个治疗性回调差异miRNA存在交集。根据miRNA测序结果，mmu-miR-203-3p在6个差异表达miRNA中差异倍数最高，P值最小。故本研究最终选择mmu-miR-203-3p进行后续验证。

为验证测序结果的准确性，选择mmu-miR-203-3p进行实时荧光定量PCR验证。结果显示，mmu-miR-203-3p在小鼠肺组织中存在显著的组间表达差异（P＜0.01），其表达趋势与高通量测序分析结果保持一致（图5）。

本研究证实QFPDD对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有防治作用，具体表现为减轻肺组织病理损伤，降低肺系数，抑制全身性炎症反应。为进一步揭示其分子机制，通过肺组织miRNA测序发现，miR-203-3p是一个关键的差异表达miRNA，且其表达变化与QFPDD的防治作用密切相关。已有研究表明，miR-203-3p可调控MAPK信号通路。例如Li等^［13］在缺血性卒中模型中证实，miR-203a-3p可通过靶向酪氨酸蛋白激酶Src抑制Src依赖的MAPK信号通路，减轻神经炎症及氧化应激。该发现提示miR-203-3p/MAPK轴在炎症调控中具有保守性作用。本研究在LPS诱导急性肺损伤模型中观察到，QFPDD可下调miR-203-3p表达，且其靶基因富集于MAPK通路，提示miR-203-3p/MAPK轴可能参与QFPDD改善急性肺损伤的过程，但该方剂在急性肺损伤中的直接靶标及调控机制仍有待进一步验证。

本研究结果显示，各组间小鼠的初始体重和终末体重均无显著差异，说明LPS诱导的急性肺损伤以及QFPDD干预未对KM小鼠的整体生长状况产生明显影响。然而，与对照组相比，模型组小鼠的肺系数显著升高，提示肺组织可能出现充血或水肿等情况^［14］。肺组织病理学检测结果显示，模型组小鼠肺组织肺泡间隔增宽，有大量炎症细胞浸润，部分肺泡扩张，少量毛细血管扩张、淤血，证实肺部出现明显的急性肺损伤性病理改变；而与模型组相比，QFPDD组肺组织病理改变有所减轻。该结果提示QFPDD可缓解急性肺损伤小鼠的肺组织病理损伤，减轻肺泡间隔增宽、炎症细胞浸润及肺泡结构破坏等病变程度，表明QFPDD可能对急性肺损伤具有一定的防治作用。

炎症因子在急性肺损伤的发病过程中起着关键作用^［15-16］。TNF-α和IL-6是两种关键促炎因子，其过度释放会加剧肺部的炎症反应^［17-19］，导致肺组织损伤和呼吸功能减弱。本研究发现，与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著升高，这与以往关于小鼠急性肺损伤的研究结果^［20-21］一致，进一步证实LPS诱导的急性肺损伤伴随着较强的炎症反应。而与模型组相比，QFPDD组小鼠血清TNF-α和IL-6水平显著降低，提示QFPDD可能对炎症因子释放具有一定的抑制作用。因此，QFPDD可能通过调节免疫平衡，抑制过度的炎症反应，从而减轻肺部的炎症损伤。

本研究通过小鼠肺组织miRNA测序发现，6个miRNA（分别为mmu-miR-203-3p、mmu-miR-181b-5p、hsa-miR-4286、mmu-miR-1843b-5p、mmu-miR-22-3p和mmu-miR-1964-3p）的表达水平在模型组与对照组比较中显著上调，在QFPDD组与模型组比较中显著下调。其中，mmu-miR-203-3p经实时荧光定量PCR验证，表达趋势与测序结果一致，并且生物信息学分析提示其可能参与调控MAPK信号通路。其余5个miRNA目前仅基于测序数据，尚未验证，其表达变化及在QFPDD防治急性肺损伤中的具体作用有待后续研究确认。Li等^［22］发现miR-203-3p可激活小胶质细胞并促进炎症因子表达。Jurčić等^［23］发现miR-203-3p在免疫球蛋白A血管炎中表达上调可加剧炎症反应，说明miR-203-3p具有促炎作用。Cai等^［24］研究表明，抑制miR-203-3p表达可通过上调雌激素受体α，减轻LPS诱导的人椎间盘炎症。本研究通过高通量测序发现，miR-203-3p为差异表达miRNA：与对照组相比，模型组miR-203-3p的表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，QFPDD组miR-203-3p表达量显著降低（P＜0.05）。结合既往研究与本实验结果推测，QFPDD可能通过下调miR-203-3p的表达，减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤炎症反应。

KEGG通路富集分析发现，QFPDD组小鼠肺组织差异表达miRNA的靶基因主要富集于MAPK信号通路和癌症相关通路等。研究表明，MAPK信号通路在细胞增殖、分化、凋亡及炎症反应等过程中发挥重要作用^［25-26］。在急性肺损伤中，MAPK信号通路的异常激活可能导致炎症因子的过度释放和肺组织的损伤^［27-28］。目前关于中药复方调控miRNA防治急性肺损伤的研究中，尚未见miR-203-3p作为核心靶点且通过MAPK通路发挥作用的文献报告。本研究推测，QFPDD可能通过调控miR-203-3p/MAPK通路轴干预急性肺损伤，抑制炎症反应，减轻肺组织损伤。

综上所述，本研究初步揭示，QFPDD可能通过下调miR-203-3p表达，调控MAPK信号通路活性，进而抑制过度炎症反应，最终减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤。本研究为QFPDD防治急性肺损伤提供了实验依据与潜在分子靶点，但差异miRNA与MAPK信号通路中具体靶基因的结合关系、QFPDD调控miRNA表达的上游机制等仍需后续通过双萤光素酶报告实验、基因敲除/过表达等技术深入验证，以期为急性肺损伤的临床防治提供新思路与方向。

李龙雪, 万崇凡, 张琦, 等. 基于miRNA测序分析清肺排毒汤防治小鼠急性肺损伤的分子机制研究[J]. 实验动物与比较医学, 2026, 46(3):311-320. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.203.

LI L X, WAN C F, ZHANG Q, et al. Molecular mechanisms of Qingfei Paidu decoction in the prevention and treatment of acute lung injury in mice based on miRNA sequencing[J]. Lab Anim Comp Med, 2026, 46(3): 311-320. DOI: 10.12300/j. issn. 1674-5817.2025.203.