脑卒中是脑血管病变导致神经功能障碍的疾病总称。我国脑卒中发病率居全球首位，是成年人致残的第一位病因^［1］。其中，约87%的患者属于缺血性脑卒中^［2］。临床上即使通过静脉溶栓和血管内治疗等干预，患者的神经功能恢复和日常生活能力仍不理想，因此需要寻找新的更有效的治疗方式。缺血性脑卒中包含多种病理生理损伤，如神经细胞缺血缺氧应激、神经兴奋性毒性、炎症反应、氧化应激等^［3］。有研究表明，铁死亡也是缺血性脑卒中的一种关键病理损伤^［4］。铁死亡发生后，细胞膜胱氨酸-谷氨酸反向转运体（system Xc^-）功能受损^［5］，细胞外胱氨酸无法转移至细胞内合成谷胱甘肽（glutathione，GSH），而GSH的缺少阻滞细胞内脂质氢过氧化物（lipid hydroperoxide，L-OOH）向脂质醇（lipid alcohol，L-OH）还原，导致过量L-OOH堆积，从而干扰Fe²⁺向细胞外转移，最终Fe²⁺的细胞内毒性过载引发神经细胞铁死亡^［6］。

外泌体是一种特殊的细胞外囊泡，直径约30～150 nm，广泛分布于体液，内含蛋白质、脂质、DNA、RNA等物质，其膜为脂质双层结构，表面分布特定的外泌体标志蛋白，如CD9、CD63、CD81，可作为靶向标志物。外泌体作为一种天然的细胞外囊泡，可作为物质运输载体穿过血脑屏障，实现神经细胞间的物质和信息交流。近年来，外泌体在神经保护、脑卒中及再灌注损伤修复等研究中受到广泛关注^［7］。外泌体可来源于多种细胞类型，包括间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、神经干细胞、免疫细胞及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等。其中，人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）来源的外泌体具有获取方便、免疫原性低、分泌量高和神经保护能力较强的特点^［8］。有研究指出，来源于脑微血管内皮细胞的外泌体可以在缺血再灌注模型中显著抑制神经元凋亡，并延长突触长度，提升突触调控蛋白表达，显示出对神经元的保护和突触重塑作用^［9］。另外，有研究使用人脐静脉内皮细胞来源的外泌体证明，外泌体能够减少细胞炎症因子表达，改善细胞存活，缓解缺血再灌注所致炎症损伤^［10］。近来研究发现，从MSCs获得的外泌体可提高细胞内铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）水平，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）、Fe²⁺的积累，抑制神经细胞铁死亡，改善小鼠急性脊髓损伤^［11］。另有研究发现，MSCs来源的外泌体及其内含的miRNA-194可通过抑制转录因子BTB与CNC同源体1（BTB and CNC homolog 1，BACH1），激活核因子-红细胞2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2）/血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）信号通路，缓解神经细胞铁死亡^［12］。

外泌体在急性缺血性脑卒中的发生发展过程中是否通过抑制铁死亡发挥其神经保护效应，以及其分子机制如何，目前尚不完全明了。因此，本研究利用电凝法建立小鼠中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，并向实验组小鼠尾静脉注射外泌体，然后通过Longa神经功能缺损评分、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色、HE染色等方法探究外泌体对MCAO小鼠脑梗死及神经细胞的缓解与保护效应；通过检测脑梗死组织中亚铁离子（Fe²⁺）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总谷胱甘肽（total glutathione，total GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）和GSH（即还原型谷胱甘肽），以及铁死亡相关因子包括NRF2、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的表达水平，探究MCAO小鼠脑梗死区域的铁死亡发生情况，以及外泌体对铁死亡调控的分子机制，以期为脑卒中、外泌体和铁死亡相关研究提供理论参考。

6～8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠32只，体重为20～25 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司［SCXK（辽）2020-0001］，质量合格证编号为210726240101571568、210726240100686636。所有动物于大连医科大学［SYXK（辽）2024-0002］屏障环境内，12 h光照/12 h黑暗环境中适应性饲养1周，相对湿度为55%～60%，温度为（24±2）℃，其间持续提供清洁饮水和饲料，保持垫料清洁干燥。所有实验均经过大连大学附属新华医院伦理审查委员会审核批准（批号2023-118-01）。

hAMSCs购自北京恩泽康泰生物科技有限公司；外泌体提取试剂盒（BB-3902）购自上海贝博生物科技有限公司；麻醉用三溴乙醇（M2940）购自南京爱贝生物科技有限公司；TTC染液（G3005）购自北京索莱宝科技有限公司；Fe²⁺（S1070S）、MDA（S0131S）和GSH测定试剂盒（S0053），TRIzol试剂（R0016），反转录试剂盒（D7168M），荧光染料TB Green（D7503），裂解缓冲液（P0013B），磷酸酶抑制剂（P1045），苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）（ST505），以及BCA蛋白定量试剂盒（P0010）均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；PCR用NRF2、SLC7A11、GPX4和GAPDH基因引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白质印迹用凝胶试剂盒（KGC4401）、通用型抗体稀释液（KGC4310）、增强型化学发光显色试剂（KGC4601-100）均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；蛋白质印迹用NRF2（SYP-M2004）、SLC7A11（SYP-R1241）、GPX4（YP-mAb-07891）、GAPDH抗体（SYP-M0946）和辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗（YPE800105）均购自深圳市优品生物科技有限公司。

纳米粒度仪（ViewSizer 3000）购自班奈自动化仪表（上海）有限公司；透射电子显微镜（Talos L120C TEM）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；高频手术镊（SJ-1）购自上海玉研科学仪器有限公司；实时荧光定量PCR仪（FQD-96A）购自杭州博日科技股份有限公司；鼓风干燥箱（GZX-9030MBE）购自上海博迅实业有限公司；台式低速离心机（Z206A）购自德国Hermle公司；10 µL微量进样器购自哈美顿（上海）实验器材有限公司；制冰机（FM-120EE）购自日本Hoshizaki公司；双蒸水仪（A4000D/220）购自英国Techne公司；高压灭菌锅（ES-315）购自Tomy Digital Biology公司；-80 °C超低温冰箱（EW86L628）购自青岛海尔集团；牙科磨头（2.35 mm#3）购自广州必富医疗器械有限公司。

hAMSCs用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养至第5代^［13］。收集500 mL hAMSCs培养上清液，于2~8 ℃保存。样品在4 ℃条件下，依次以3 000×g和10 000×g速度离心15 min和20 min，分别去除细胞及细胞碎片，每次离心后收集上清液。将获得的上清液转移至外泌体纯化离心管的C（大）内管中，4 000×g离心10~15 min，浓缩至约5~10 mL；加入200 μL外泌体提取液A，再次以4 000×g离心10~15 min，保留5~10 mL浓缩液。吸取该浓缩液并转移至外泌体纯化离心管的D（小）内管中，加入5 mL外泌体提取液B，于4 ℃条件下11 000~13 000×g离心10~15 min，收集10 mL洗脱液备用。取200 μL外泌体洗脱液，用透射电子显微镜观察，并使用纳米粒度仪进行粒径分析，即检测洗脱液中外泌体的粒径大小，然后将提取的外泌体置于-80 ℃冰箱保存。

采用随机数字表法将小鼠随机分为4组：假手术组（Sham）、模型组（MCAO）、模型+生理盐水组（MCAO+NaCl）、模型+外泌体组（MCAO+EXO），每组8只。MCAO+EXO组小鼠经尾静脉注射100 μL提取的外泌体（密度为9.5×10¹¹个/mL），MCAO+NaCl组小鼠经尾静脉注射100 μL生理盐水（即0.9%NaCl溶液）。24 h后，将小鼠以10 μL/g体重的剂量腹腔注射2.5%三溴乙醇麻醉，放在手术台上，右侧卧位，用胶带固定四肢，然后将手术台置于体视显微镜下行造模操作。Sham组小鼠只暴露大脑中动脉，不电凝血管，其余各组小鼠使用高频手术镊以8 W功率电凝大脑中动脉。

参考已报道的电凝法^［14］构建MCAO模型。用手术剪刀沿小鼠左眼外眦与左耳外耳道连线靠近眼睛处做一垂直切口，切口长度以充分暴露颞肌为宜（约2～3 cm）。用高频手术镊以15 W功率电凝颞肌以暴露颅骨，用牙科磨头打磨大脑中动脉所在位置的头骨，直至大脑中动脉透亮可见，用眼科镊揭去最后一层骨膜以充分暴露大脑中动脉，然后用高频手术镊以8 W功率电凝大脑中动脉。大脑中动脉起自颈内动脉，沿侧脑裂向颞叶表面延伸，主干及分支呈红色血管条纹清晰可见。随着持续电凝，大脑中动脉逐渐被阻断，血流供应消失。术后对小鼠缝合手术切口，并将其置于头部向下约30°的体位，单独饲养于独立笼中，留作观察。

小鼠造模24 h后行Longa神经功能缺损评分^［15］，评分依据如下：0分，没有神经功能缺损（活动无异常）；1分，轻微神经功能损伤，即拎起小鼠尾巴使其离开地面后，其右前爪无法伸直；2分，中度神经功能损伤，即小鼠向前运动时向右侧转圈；3分，严重神经功能损伤，即小鼠向前运动时向右侧倾倒；4分，无法自主运动或失去意识。以颈椎脱臼法安乐死小鼠，再行心脏灌注30 mL生理盐水，取出小鼠完整大脑。随后用洁净刀片切取梗死区域及其周围组织，梗死区域体积约占80%，并置于-80℃冰箱中保存。用于HE染色的脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定保存。

小鼠脑组织取材后存放于-80 ℃冰箱定型30 min后取出，用手术刀将脑组织沿冠状位方向切成约2 mm厚的薄片，将脑组织切片放入2% TTC染液中，30 ℃孵育30 min，每隔5 min摇晃一次，使染色均匀。将染色后的脑组织切片按照层次顺序依次排列成一行，拍照记录并保存。使用ImageJ软件统计脑组织（正常呈红色）总面积和梗死区域（呈白色）的面积，并计算梗死体积占比。梗死体积占比=（白色梗死区域的面积/脑组织总面积）×100%^［16］。

小鼠脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，PBS冲洗3次以去除残余甲醛后，经梯度乙醇溶液（75%、85%、95%、无水乙醇，各5 min）脱水，并于二甲苯中透明（10 min×2次）。随后在60 ℃条件下依次置于二甲苯∶石蜡等比混合液中浸蜡1 h，再于纯石蜡中浸蜡1 h（2次），完成后进行石蜡包埋并制备厚度为5 μm的切片，贴附于载玻片上备用。切片在60 ℃恒温箱中烤片1 h后，经二甲苯脱蜡（10 min×2次）及梯度乙醇溶液（无水乙醇、95%、85%、75%，各5 min）复水，蒸馏水水化3 min。随后滴加苏木精染液染色2 min，流水冲洗后用1%盐酸乙醇分化1 s，再经梯度乙醇溶液脱水；接着置于伊红染液中染色1 min，经95%乙醇溶液和无水乙醇脱水，二甲苯透明（10 min×2次），最后用中性树胶封固。封固后的切片在光学显微镜下观察并拍摄图像，在×40、×100两种放大倍率视野下观察脑组织病理学变化，主要包括是否存在胞体空泡样变性、细胞核固缩或碎裂、核结构清晰度，以及神经元排列的完整性和有序性。

造模24 h后，取200 mg小鼠脑组织（梗死区域约占80%）于1.5 mL EP管中。向每100 mg脑组织加入900 μL预冷的裂解缓冲液，在冰浴上使用研磨棒匀浆20~30 s，直至组织完全匀浆，随后在4 ℃条件下10 000×g离心10 min，收集上清液。用测定试剂盒对小鼠脑组织中Fe²⁺、MDA、total GSH、GSSG含量进行测量，即在520 nm波长处测定样本中Fe²⁺的吸光度值，在532 nm波长处测定样本中MDA的吸光度值，在412 nm波长处测定样本中total GSH和GSSG的吸光度值，然后按照说明书中提供的公式计算各分子含量。GSH的含量为total GSH含量与GSSG含量的差值。

取适量小鼠脑梗死区及周围组织，使用TRIzol试剂提取组织总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，使用无酶水配成终质量浓度为5 ng/μL。实时荧光定量PCR反应体系共10 μL，包括2×TB Green 5 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 4 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2^-△△Ct 法计算NRF2、SLC7A11、GPX4基因的mRNA相对表达量。实时荧光定量PCR引物序列见表1。

将各组小鼠脑梗死区及其周围组织取出，用预冷的PBS漂洗2～3次后，每100 mg组织加入1 mL预冷的裂解缓冲液、10 μL磷酸酶抑制剂和10 μL PMSF，在冰上充分匀浆裂解。然后于4 ℃条件下14 000×g离心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中蛋白浓度，并用裂解液将各组蛋白调整至5 µg/µL。取50 µg蛋白样品，加入1/4体积的5×上样缓冲液，混匀后于100 ℃水浴中煮沸5 min进行变性。蛋白样品经10% SDS-PAGE分离，电泳条件为80 V 40 min后调整至120 V 50 min，直至染料到达胶底部。

电泳结束后，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上（200 mA，60 min）。转膜完成后，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，随后于4 ℃条件下孵育一抗过夜。一抗包括抗NRF2抗体、抗SLC7A11抗体、抗GPX4抗体及抗GAPDH抗体，均按1∶1 000稀释。一抗孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次10 min；随后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶20 000稀释），室温孵育2 h。洗膜后滴加增强型化学发光显影液，在凝胶成像系统暗室条件下进行显影检测。采用ImageJ软件对目的蛋白条带的灰度值进行分析，并以GAPDH作为内参进行归一化处理。

使用GraphPad Prism 9.1软件对实验结果数据进行分析并绘图。数据服从正态分布时，以x¯±s表示。服从正态分布且方差齐性的多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

透射电子显微镜下观察可见，hAMSCs悬液中有大量呈球状的外泌体（图1A）。通过粒径分析显示，外泌体直径约100 nm，且粒径分布集中、杂峰较少。结果提示，外泌体纯度较高，异质性较低（图1B）。

采用电凝法构建MCAO小鼠模型（图2A~D）后，脑切片TTC染色结果（图2E和图3B）显示，MCAO模型小鼠脑组织中出现明显的白色梗死区域，而Sham组未见明显梗死灶，表明通过电凝法成功构建了小鼠MCAO模型。为评估MCAO模型小鼠的神经功能损伤程度，采用Longa神经功能缺损评分法进行行为学评价（图3A）。Longa评分显示：Sham组得分为0，MCAO组小鼠得分为2.80±0.45，说明MCAO小鼠的神经功能出现了显著损伤；MCAO+NaCl组得分（2.60±0.54）与MCAO组相比的差异无统计学意义（P>0.05），表明外泌体溶剂未干扰实验结果；MCAO+EXO组Longa评分（1.60±0.54）显著低于MCAO组（P＜0.01），表明hAMSCs来源的外泌体干预可显著改善MCAO模型小鼠的神经功能缺损情况。

对小鼠脑组织（图3B）中梗死体积占比进行定量分析，结果显示：相比于Sham组无梗死区占比［（0.00±0.00）%］，MCAO组的梗死体积占比［（28.44±2.10）%］显著上升（P<0.001），说明MCAO模型构建成功；相较于MCAO组，MCAO+EXO组的梗死体积占比［（14.50±2.93）%］显著下降（P<0.001，图3C）。

将小鼠脑组织石蜡切片进行HE染色，在×40视野下可见：与MCAO组相比，MCAO+EXO组脑组织神经元细胞形态规则，排列较为紧密，间质水肿轻微，提示外泌体干预后神经损伤程度减轻，损伤范围缩小，具有保护作用。在×100视野下可见，与Sham组相比，MCAO组和MCAO+NaCl组小鼠出现神经细胞空泡变性且排列不整齐，而MCAO+EXO组小鼠神经细胞结构较完整，神经元排列较紧密整齐，结构正常的神经元数量增加，表明hAMSCs来源的外泌体干预可显著改善MCAO模型小鼠脑组织的病理学损伤情况，减轻神经元结构破坏（图4）。

微量比色法检测结果显示：与Sham组小鼠梗死区及其周围脑组织中Fe²⁺含量［（0.022±0.001）µmol/g］相比，MCAO组Fe²⁺含量［（0.034±0.001） µmol/g］显著增加（P<0.000 1）；相较于MCAO组，MCAO+EXO组Fe²⁺含量［（0.028±0.001）µmol/g］显著减少（P<0.01，图5A）。与Sham组小鼠脑组织中MDA含量［（4.00±0.21）nmol/gprot］相比，MCAO组MDA含量［（5.85±0.32）nmol/gprot］显著增加（P<0.000 1）；相较于MCAO组，MCAO+EXO组MDA含量［（4.81±0.39）nmol/gprot］显著减少（P<0.01，图5B）。以上结果说明，外泌体可减少MCAO模型小鼠脑组织中Fe²⁺和MDA含量。

相较于Sham组脑组织中total GSH［（10.62±0.41）mmol/L］、GSSG［（2.00±0.11）mmol/L］和GSH含量［（7.90±0.31）mmol/L］，MCAO组total GSH含量［（6.40±0.10）mmol/L］、GSSG［（2.41±0.12）mmol/L］和GSH含量［（4.02±0.08）mmol/L］显著减少（P<0.000 1，P<0.01，图5C~E）；相较于MCAO组，MCAO+EXO组total GSH含量［（7.40±0.25）mmol/L］和GSH含量［（5.73±0.38）mmol/L］显著增加（P<0.001，图5C、E），而GSSG含量无显著差异（P>0.05，图5D）。以上结果表明，外泌体可提升MCAO模型小鼠脑组织中total GSH和GSH水平。

实时荧光定量PCR检测各组小鼠梗死区及其周围脑组织中铁死亡相关抑制分子NRF2、SLC7A11、GPX4的mRNA转录水平，结果显示：相较于Sham组的NRF2、SLC7A11和GPX4 mRNA相对水平（分别为0.92±0.18、1.17±0.04和1.04±0.14），MCAO组的NRF2、SLC7A11和GPX4 mRNA相对水平（分别为0.30±0.04、0.33±0.04和0.36±0.15）均显著降低（P<0.01）；相较于MCAO组，MCAO+EXO组的NRF2、SLC7A11和GPX4 mRNA相对水平（分别为0.77±0.10、0.67±0.09和0.84±0.11）显著升高（P<0.05，图6A～C）。以上结果表明，外泌体可促进MCAO模型小鼠铁死亡抑制分子NRF2、SLC7A11、GPX4的mRNA转录。

蛋白质印迹法检测小鼠脑梗死区及周围脑组织内NRF2、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平，结果显示：MCAO组NRF2、SLC7A11和GPX4的蛋白相对表达量（分别为0.73±0.05、0.63±0.01和0.60±0.04）较Sham组（分别为0.99±0.01、0.90±0.01和0.97±0.04）显著降低（P<0.001）；MCAO+EXO组NRF2、SLC7A11和GPX4的蛋白相对表达量（分别为0.85±0.05、0.76±0.05和0.76±0.01）较MCAO组显著升高（P<0.05，图6D～G）。这与实时荧光定量PCR结果一致，说明外泌体可在mRNA、蛋白质两个层面，促进MCAO小鼠铁死亡相关抑制分子NRF2、SLC7A11和GPX4的表达，从而抑制神经细胞铁死亡。

脑卒中引发的神经损伤涉及多种机制，如细胞兴奋性毒性、氧化应激、细胞凋亡、神经炎症、血脑屏障损伤等^［17］。此外，铁死亡在近年来越来越受到研究者的重视。铁死亡是细胞程序性死亡的一种独特形式，其特征表现为脂质过氧化和ROS在细胞内蓄积。与3种主要类型的细胞程序性死亡（凋亡、坏死性凋亡和焦亡）不同，铁死亡没有特异性调节基因或蛋白质，而是由多种信号通路互相作用的综合结果^［18］。研究发现，外泌体可通过内含物调控细胞铁死亡，脂肪干细胞来源的外泌体可通过激活KEAP1/NRF2/GPX4通路减轻肺微血管内皮细胞的铁死亡^［19］；MSCs来源的外泌体可通过增强SLC7A11的稳定性，减少肝细胞铁死亡^［20］。本研究通过Longa神经功能评分和TTC染色评估发现，hAMSCs来源的外泌体显著改善MCAO小鼠神经功能，并减少脑梗死面积，提示外泌体对神经细胞损伤具有保护作用，可以改善小鼠神经功能。为探究外泌体保护神经细胞的作用机制，本研究检测了铁死亡相关指标Fe²⁺、MDA、total GSH、GSSG、GSH的含量，结果发现MCAO+EXO组小鼠的上述指标相较MCAO模型小鼠都发生了显著改善。进一步的分子机制研究提示，NRF2/SLC7A11/GPX4抗氧化通路的激活可能是外泌体发挥神经保护效应的重要原因。

外泌体是一类直径约30~150 nm的细胞外囊泡，可来源于多种细胞类型，如MSCs、神经干细胞、免疫细胞及iPSCs等。常用的外泌体分离方法包括超速离心、密度梯度离心、聚合物沉淀法、尺寸排阻过滤及免疫亲和法等。本研究在细胞来源和分离策略上具有独到之处：选择hAMSCs不仅具备神经保护潜力、低免疫原性和伦理可行性，也特别适合脑缺血或神经损伤研究；而外泌体分离采用了多步组合策略，包括初步离心和过滤、切向流过滤浓缩、快速外泌体/细胞外囊泡纯化柱尺寸排阻纯化以及0.22 µm洗脱，不仅兼顾了产量和纯度，也保证了外泌体的结构完整性，比传统方法更适合大规模制备和临床应用。同时，对于MCAO模型的构建，相较于传统的线栓法^［21］，本研究采用了操作更便捷的电凝法，全程在显微镜下操作，确保仅凝闭大脑中动脉干，不影响颈内动脉其他分支，保证局灶性缺血而非大面积梗死。此法更适合中动脉较细的小鼠等模式动物，后续通过Longa评分及TTC染色进一步证实了该法的有效性。

Longa神经功能缺损评分可用于MCAO模型建立后小鼠神经功能损伤程度的评价。本研究发现MCAO+EXO组小鼠的Longa评分显著低于MCAO组小鼠，提示MCAO+EXO组小鼠的运动能力在外泌体干预后得到显著改善。

TTC染色可测定脑组织梗死体积。本研究发现MCAO+EXO组小鼠脑梗死体积占比显著低于MCAO组，表明外泌体可抑制脑神经细胞死亡，减少脑缺血梗死体积。但实验中有少许MCAO+EXO组小鼠的Longa评分和TTC染色梗死体积与MCAO组小鼠相比差异较小，这可能与MCAO造模手术操作的微小差异、外泌体在脑组织中的分布和吸收效率差异、缺血严重程度的轻微差异等因素有关。后续研究需尽可能扩大样本量，以避免上述因素对实验结果分析的干扰。

本研究通过HE染色观察了脑缺血梗死区神经细胞的形态，结果发现：相较于MCAO组小鼠，MCAO+EXO组小鼠神经细胞结构更为完整，细胞核大而规整且位于细胞中央，神经元排列紧密、整齐，正常结构的神经元数量增加。神经细胞形态结果表明，外泌体干预可减少MCAO模型小鼠的神经细胞损伤。

Fe²⁺、MDA、total GSH、GSSG和GSH是监测铁死亡的常用指标。本研究发现，MCAO+EXO组小鼠的total GSH含量相较于MCAO组小鼠显著升高，推测主要原因是细胞内total GSH合成增多。MCAO+EXO组小鼠神经细胞内GSSG水平较MCAO组无显著差异，可能原因是外泌体干预加速了GSSG还原以抵抗氧化应激损伤。MCAO+EXO组小鼠脑组织中Fe²⁺和MDA含量显著低于MCAO组，表明外泌体可抑制脑梗引发的神经细胞铁死亡过程。

NRF2是细胞内重要的抗氧化转录因子。NRF2通过与抗氧化反应元件结合，调控多种抗氧化基因如NAD（P）H：醌氧化还原酶1、谷胱甘肽合成酶催化亚基/调节亚基和硫氧还蛋白还原酶1的转录，在缺血性脑损伤中对抗氧化应激发挥重要作用^［22］。NRF2激活后可防止神经元线粒体去极化、ATP耗竭和呼吸功能受损，保护个体免受脑缺血损伤^［23］。SLC7A11是Xc^-的重要组成部分，负责将细胞外胱氨酸转移至细胞内，促进半胱氨酸及后续GSH的合成。GPX4以GSH为辅因子，可催化细胞内L-OOH还原为L-OH，是细胞内重要的抗氧化酶。在发生缺血性脑卒中时，神经细胞中SLC7A11、GPX4表达上调，可防止细胞内ROS积累并抑制铁死亡，从而减少脑缺血性损伤^［24-25］。本研究在mRNA、蛋白两个水平上同时发现，MCAO+EXO组的NRF2、SLC7A11、GPX4表达水平均显著高于MCAO组，表明外泌体可通过激活NRF2/SLC7A11/GPX4通路，减少MCAO模型小鼠脑神经细胞铁死亡。

本研究尚有不足，如未揭示不同细胞来源外泌体、不同给药方式（如鼻腔给药、侧脑室注射给药、腹腔给药）等因素对外泌体抑制神经细胞损伤疗效的影响及其机制，未明确外泌体抑制神经细胞铁死亡的具体有效成分（如microRNA），这些均有待后续深入研究。

综上所述，本研究证实了在小鼠MCAO模型中，尾静脉注射hAMSCs来源的外泌体可改善小鼠运动功能，减少脑梗死面积，维护神经细胞形态，降低神经损伤程度；初步的机制研究提示，外泌体可通过激活NRF2/SLC7A11/GPX4通路，减少MCAO模型小鼠的神经细胞铁死亡。本研究结果可能为今后缺血性脑卒中的临床治疗提供理论参考。

徐英韬, 王蒙蒙, 林平, 等. 外泌体通过NRF2/SLC7A11/GPX4 通路调控铁死亡治疗小鼠缺血性脑卒中[J]. 实验动物与比较医学, 2026, 46(1):20-31. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.034.

XU Y T, WANG M M, LIN P, et al. Exosomes treat ischemic stroke by regulation of ferroptosis through the NRF2/SLC7A11/GPX4 pathway in mice[J]. Lab Anim Comp Med, 2026, 46(1): 20-31. DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2025.034.