实验动物与比较医学, 2025, 45(2): 229-238 DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2024.178

实验动物资源开发与利用

登革病毒对树鼩不同组织来源细胞的易感性及感染特性研究

刘欣1, 杞梦迪1, 王文广1, 罕园园1, 陆美丽1,2, 李娜1, 代解杰,1, 陆彩霞,,1

1.北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所, 昆明 650118

2.云南大学生命科学学院, 昆明 650500

Study on Susceptibility and Infection Characteristics of Dengue Virus in Cells Sourced from Different Tissues of Tree Shrews

LIU Xin1, QI Mengdi1, WANG Wenguang1, HAN Yuanyuan1, LU Meili1,2, LI Na1, DAI Jiejie,1, LU Caixia,,1

1.Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China

2.School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650500, China

通讯作者: 代解杰（1961—），男，研究员，博士生导师，研究方向：人类疾病动物模型建立与比较医学。E-mail：djj@imbcams.com.cn。ORCID： 0000-0002-4242-9089；陆彩霞（1979—），女，博士，主任技师，硕士生导师，研究方向：人类疾病动物模型建立。E-mail：lcx@imbcams.com.cn。ORCID：0000-0001-7186-7451

收稿日期: 2024-12-03   修回日期: 2025-02-09  

基金资助: 云南省科技计划项目“云南省眼科疾病防治研究重点实验室”.  2017DG008
昆明市科技创新团队“树鼩细胞资源库建立及病毒性疾病动物模型研究创新团队”.  2019-1-R-24483

Corresponding authors: DAI Jiejie (ORCID: 0000-0002-4242-9089), E-mail:djj@imbcams.com.cn;LU Caixia (ORCID: 0000-0001-7186-7451), E-mail:lcx@imbcams.com.cn

Received: 2024-12-03   Revised: 2025-02-09  

作者简介 About authors

刘欣（1999—），女，硕士研究生，研究方向：人类疾病动物模型建立及机制研究。E-mail：livxin@student.pumc.edu.cn

代解杰，北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所课题组长，二级教授，博士生导师。现兼任中国实验动物学会第二届监事会监事，中国实验动物学会实验动物资源鉴定与评价工作委员会以及屏障医学专业委员会副主任委员，中国实验动物学会标准化委员会委员，云南省实验动物学会副理事长，《中国实验动物学报》和《实验动物与比较医学》副主编。从事实验动物学、病原生物学等相关研究与管理工作40年，先后主持国家科技支撑计划、国家自然科学基金、云南省自然科学基金，以及WHO、美国和日本等国际合作项目数十项。作为云南省树鼩标准化研究与人类疾病树鼩模型创建创新团队负责人，率先攻克了树鼩繁殖关键技术，建立了中国最大的树鼩种质资源基地，为中国实验动物新品种的研发提供了重要的经验和示范。先后获云南省科技进步奖一等奖2项、二等奖1项、三等奖4项，云南省自然科学奖二等奖1项，中国实验动物学会科学技术奖一等奖3项；被评为全国优秀科技工作者、云南省中青年学术技术带头人、云南省有突出贡献的优秀专业技术人员。组织制定了云南省地方标准5项，中国实验动物学会团体标准6项；发表学术论文100余篇，其中SCI论文40余篇；获国家发明专利授权19项，出版著作多部。

陆彩霞，医学博士，北京协和医学院/中国医学科学院硕士生导师、昆明医科大学硕士生导师，云南省中青年学术和技术带头人，昆明市树鼩细鼩胞资源库及病毒性疾病动物模型研究创新团队带头人，云南省卫生健康委医学学科带头人。主要从事实验动物相关工作，主要研究方向为实验动物新品种的培育与开发，以及人类疾病动物模型构建。主持和参加国家级和省级项目多项，作为技术骨干完成的研究成果先后获得2012年云南省科学技术进步奖一等奖（排名第八）、2014年中国实验动物学会科学技术奖一等奖（排名第四）、2018年云南省科学技术进步奖二等奖（排名第七）和2021年云南省科学技术进步奖二等奖（排名第二），并曾获2022年度中国实验动物学会青年科学家奖。发表论文20余篇，参与制定2项云南省地方标准，获国家专利16项，参编专著3部。现任《实验动物与比较医学》和《实验动物科学》编委，《中国实验动物学报》和《中国比较医学杂志》通信编委，全国研究生教育评估监测专家库成员，国家自然科学基金委网络评议人。

摘要

目的 探究登革病毒（dengue virus，DENV）对树鼩不同组织来源细胞的易感性及感染特征，为扩充DENV的树鼩易感细胞库提供依据。 方法 将DENV以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.02的剂量分别接种于树鼩皮肤成纤维细胞（tree shrew skin fibroblasts，TSFs）、原代树鼩肾上皮细胞（primary tree shrew renal epithelial cells，pTRECs）、树鼩主动脉内皮细胞（tree shrew aortic endothelial cells，TAECs）、树鼩主动脉平滑肌细胞（tree shrew aortic smooth muscle cells，TASMCs）、树鼩肝细胞（tree shrew hepatocytes，THs）、树鼩角膜基质细胞（tree shrew corneal stromal cells，TCSCs）、树鼩脑微血管内皮细胞（tree shrew brain microvascular endothelial cells，TBMECs）及树鼩视网膜微血管内皮细胞（tree shrew retinal microvascular endothelial cells，TRMECs），用常规培养DENV的C6/36、Vero、A549及BHK-21细胞系作为阳性对照。在感染病毒后6 d内，每12 h用倒置显微镜观察各种细胞的病变效应，用实时荧光定量PCR检测细胞培养物中病毒核酸载量，绘制病毒增殖曲线，用噬斑实验检测病毒滴度。 结果 除TRMECs外，DENV对7种树鼩细胞均易感。随着感染时间的延长，7种树鼩细胞均出现变圆、脱落、坏死及裂解等明显的病变效应。在pTRECs、TBMECs、TASMCs、TAECs和THs这5种树鼩细胞的培养裂解物中检测到的病毒核酸载量与4种阳性对照细胞接近，大于4×107 拷贝/μL。以上5种树鼩细胞均能产生感染性子代病毒，其中3种树鼩细胞TAECs（3.13×105 PFU/mL）、THs（2.03×105 PFU/mL）、pTRECs（1.58×105 PFU/mL）中的DENV滴度较接近阳性对照细胞 C6/36（3.85×105 PFU/mL），且能更早收获病毒。 结论 DENV对树鼩多种组织来源的细胞易感，且病毒增殖速度快于常见其他物种来源的传代细胞系，其中TAECs、THs和pTRECs尤其适于DENV增殖培养。同时，这些细胞可能参与DENV在树鼩体内的感染。

关键词： 树鼩细胞 ; 登革病毒 ; 细胞病变效应 ; 病毒增殖曲线 ; 病毒感染

Abstract

Objective To investigate the susceptibility and infection characteristics of dengue virus (DENV) in cells derived from diverse tissues of tree shrews and to provide a basis for expanding the repertoire of DENV-permissive cell models in this species. Methods DENV was inoculated at a multiplicity of infection (MOI) of 0.02 into tree shrew skin fibroblasts (TSFs), primary tree shrew renal epithelial cells (pTRECs), tree shrew aortic endothelial cells (TAECs), tree shrew aortic smooth muscle cells (TASMCs), tree shrew hepatocytes (THs), tree shrew corneal stromal cells (TCSCs), tree shrew brain microvascular endothelial cells (TBMECs), and tree shrew retinal microvascular endothelial cells (TRMECs). C6/36, Vero, A549, and BHK-21 cells (commonly used for DENV propagation) were used as positive controls. Over 6 days post-infection, cellular cytopathic effects were monitored at 12-hour intervals using an inverted microscope, viral RNA loads in cell lysates were quantified by real-time fluorescent quantitative PCR to generate proliferation curves, and viral titers were determined by plaque assay. Results Seven types of tree shrew cells, except TRMECs, were susceptible to DENV. Prolonged infection induced pronounced cytopathic effects, including cell rounding, detachment, necrosis, and lysis, across all susceptible cells. The viral RNA loads detected in lysates of pTRECs, TBMECs, TASMCs, TAECs and THs, approached those of positive controls (≥4×10⁷ copies/μL). Infectious progeny viruses were produced by these five cell types, with three (TAECs, 3.13×105 PFU/mL; THs, 2.03×105 PFU/mL; pTRECs, 1.58×105 PFU/mL) exhibiting titers comparable to C6/36 (3.85×10⁵ PFU/mL) and earlier viral harvests. Conclusion DENV exhibits broad susceptibility to tree shrew cells of multiple tissue origins, with proliferation rates surpassing those of conventional cell lines sourced from other species. TAECs, THs, and pTRECs are particularly suitable for large-scale DENV proliferation, suggesting their potential involvement in in vivo infection.

Keywords： Tree shrew cells ; Dengue virus ; Cytopathic effect ; Viral proliferation curves ; Viral infection

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本文引用格式

刘欣, 杞梦迪, 王文广, 等. 登革病毒对树鼩不同组织来源细胞的易感性及感染特性研究[J]. 实验动物与比较医学, 2025, 45(2): 229-238. DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2024.178.

LIU Xin, QI Mengdi, WANG Wenguang, et al. Study on Susceptibility and Infection Characteristics of Dengue Virus in Cells Sourced from Different Tissues of Tree Shrews[J]. Laboratory Animal and Comparative Medicine, 2025, 45(2): 229-238. DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2024.178.

登革病毒（dengue virus，DENV）是黄病毒科、黄病毒属的一种单股正链RNA病毒，主要有4种血清型，均可通过伊蚊（埃及伊蚊和白纹伊蚊）叮咬传播给人类，并在人类和蚊子之间循环，部分非人灵长类动物作为储存宿主也可参与传播［1］。近几十年来，DENV感染所引起的一系列疾病的发生率激增，从2000年的50.54万例增加到2024年报告的超760万例（截至2024年4月30日），给全球公共卫生系统造成了重大疾病负担［2］，但目前尚无有效的疫苗和药物［3］。由于缺乏与人类感染DENV相似的动物模型，严重阻碍了其疾病机制、疫苗与药物的研究开发工作［4-5］。

目前用于DENV体外研究的细胞模型有非洲绿猴肾细胞Vero、叙利亚仓鼠肾细胞BHK-21、幼蚊细胞C6/36、人非小细胞肺癌细胞A549及人脐静脉内皮细胞HUVEC等，它们对DENV有较高的敏感性［6-8］。然而，DENV在C6/36细胞中的复制动力学及细胞免疫应答特征可能与人体生理反应有所不同［9］；DENV在Vero、BHK-21细胞中连续传代会出现毒力减弱的情况［8-10］。此外，Vero细胞存在Ⅰ型干扰素（typeⅠ interferons，IFN-Ⅰ）分泌缺陷［11］，该细胞用于DENV机制研究可能导致结果出现偏差。由于常用细胞系存在一定不足，需要筛选更多易感细胞系，为不同的研究目的提供更多选择。已有研究结果证实，从树鼩不同组织分离的多种细胞可用于病毒感染研究。例如，Zhao等［12］证实，原代树鼩肝细胞易受丙型肝炎病毒感染；Zhang等［13］发现，树鼩肾、肺、肝、皮肤和主动脉的原代细胞易受寨卡病毒感染，并诱导原代皮肤和原代胸主动脉细胞产生先天性抗病毒反应；Kayesh等［14］发现，树鼩肺成纤维细胞对4种血清型的DENV都具有易感性；丁相荣等［15］发现，DENV在树鼩角膜基质细胞（tree shrew corneal stromal cells，TCSCs）上出现病变的时间早于Vero细胞。以上研究表明，树鼩细胞在DENV相关研究中具有较大潜力。然而，树鼩细胞系对DENV的易感性及感染特征数据十分匮乏。

本研究选择DENV入侵的主要靶器官（皮肤、血管、肝、肾等）［16-17］来源的树鼩细胞和本实验室已开展研究的TCSCs［15］为研究对象，并以常规培养用细胞系C6/36、Vero和BHK-21为阳性对照，探究8种树鼩细胞对DENV的易感性及感染特性，以期扩充DENV的易感细胞库，同时为后续体内实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒株

8种树鼩细胞系包括树鼩主动脉内皮细胞（tree shrew aortic endothelial cells，TAECs）、树鼩主动脉平滑肌细胞（tree shrew aortic smooth muscle cells，TASMCs）、树鼩肝细胞（tree shrew hepatocytes，THs）、原代树鼩肾上皮细胞（primary tree shrew renal epithelial cells，pTRECs ）、树鼩皮肤成纤维细胞（tree shrew skin fibroblasts，TSFs）、TCSCs、树鼩脑微血管内皮细胞（tree shrew brain microvascular endothelial cells，TBMECs）、树鼩视网膜微血管内皮细胞（tree shrew retinal microvascular endothelial cells，TRMECs），均由本实验室分离鉴定，稳定传代后保存。

4种阳性对照细胞系包括C6/36细胞（由中国医学科学院医学生物学研究所孙强明研究员惠赠，并由本实验室稳定传代后保存），以及A549细胞、Vero细胞和BHK-21细胞（均为本实验室传代保存）。

DENV Ⅱ型43株（GenBank： AF204178），由清华大学程功实验室惠赠，由本实验室经C6/36扩增后保存。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F-12（1∶1）培养基（VivaCell，C3130-0500）和PBS（VivaCell，C3580-0500）为上海逍鹏生物科技有限公司产品；RPMI 1640培养基（C11875500BT）、青霉素-链霉素溶液（Gibco，15140-122）和胰蛋白酶（Gibco，25200-056）为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；胎牛血清（CellBox，CF-01P-02）为长沙赛尔博克斯生物科技有限公司产品；QIAamp®病毒RNA小提试剂盒（52906）为德国Qiagen公司产品；One Step Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒（RR064A）为日本TaKaRa公司产品；低熔点琼脂糖（Biosharp，BS384）和结晶紫染色液（Solarbio，G1062）为北京杰兰柯科技有限公司产品；引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

35 mm细胞培养皿（706001）为无锡耐思生命科技股份有限公司产品；细胞计数仪（TC20）为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；定时定量PCR仪（BFX-950）为美国Bio-Rad公司产品；生物安全柜（1287）和恒温培养箱（CO2T/C）为美国FORMA公司产品；倒置荧光相差显微成像系统（ECLIPSE Ti-S）为日本Nikon公司产品。

1.3 实验室生物安全条件

依据《人间传染的病原微生物目录》（国卫科教发〔2023〕24号）和《病原微生物实验室生物安全管理条例》（2018年3月19日修订版），DENV体外研究所需生物安全实验室等级为BSL-2。本研究在中国医学科学院医学生物学研究所药物安全评价中心病原微生物安全实验室开展，实验室的生物安全备案证号为2024SW0025。

1.4 细胞培养及病毒接种

所有细胞复苏后接种于T25培养瓶。C6/36细胞使用RPMI 1640完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素），于5% CO2、28 ℃培养箱培养；其他细胞使用DMEM/F-12（1∶1）完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素），于5%CO2、37 ℃培养。当细胞生长至80%～90%时，接种于多个35 mm直径的细胞培养皿，过夜培养12 h以上。细胞汇合度约为60%～70%时，计数。弃去原培养液，用PBS洗一次。感染组加入500 μL维持液（含2%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的培养基），以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.02的剂量分别将病毒液接种于感染组培养皿中，孵育2 h；所有树鼩细胞和阳性对照细胞设置未感染的阴性对照组，仅加入等体积维持液。弃去培养液，PBS洗一次，加入2 mL维持液（含2%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的培养基），继续培养。

1.5 细胞病变观察

每隔12 h在倒置显微镜下观察感染组和对照组的细胞形态，拍照并记录细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）；同时取4份感染组培养皿，封口后移入-80 ℃冰箱冻存。各组均观察至病变终点（≥95%CPE）或未感染细胞老化死亡。未见CPE记为“-”；疑似CPE记为“±”；0%～25%CPE记为“+”；26%～50%CPE记为“++”；51%～75%CPE记为“+++”；76%～100%CPE记为“++++”。

1.6 病毒增殖检测

将冻存的细胞培养皿于-80 ℃冻融两次，使细胞充分裂解。将培养皿内所有液体，连同细胞碎片，一同移入离心管后，1 200×g、4 ℃离心10 min，收集上清液。用QIAamp®病毒RNA小提试剂盒提取病毒基因组RNA。用One Step Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，检测病毒核酸载量。DENV C基因引物设计参考文献［18］，正向引物（DENV-F）序列为：5'-AATTAGAGAGCAGATCTCTGATGAA-3'，反向引物（DENV-R）序列为5'-AGCATTCCAAGTG-AGAATCTCTTTGT-3'；探针（Probe）序列为5'-FAM-CTGTTGTACAGTCGACACGCGGTTTCTC-BHQ1-3'。反应体系包括2×一步式RT-PCR反应液Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS聚合酶（5 U/μL）、PrimeScript RT酶混合液Ⅱ、正反向引物（10 μmol/L）和探针各0.4 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，总RNA 1 μL，反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，循环40次。分别以感染后小时数（hours post infection，hpi）和起始模板量对数值（log10 copies/μL）的平均值，绘制不同树鼩细胞中的病毒增殖曲线，并与阳性对照细胞进行比较。

1.7 病毒滴度测定

当细胞病变程度达到75%～80%时（即CPE刚达到最大），病毒的复制和释放达到相对较高的水平，此时是收获病毒的适宜时间。根据1.6节中获得的病毒核酸载量检测结果，选择载量最高的前5种细胞用于DENV的培养。在各培养细胞病变达到75%~80 %时收获病毒液，并采用噬斑实验测定不同细胞的病毒感染性滴度。步骤如下：用维持液（含2%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的培养基）10倍梯度稀释病毒液（10-1～10-5），接种于长成单层的Vero细胞，每个梯度接种2孔，对照孔加入不含病毒的维持液，置于细胞培养箱中孵育2 h；弃去孵育液，PBS洗涤；将2%低熔点琼脂糖和培养基（含4%胎牛血清、2%青霉素-链霉素）按1∶1混合，待温度降至37 ℃左右时将混合液覆盖于细胞孔上，继续培养7 d。待形成噬斑后，加入4%甲醛溶液固定1 h，用流水轻轻洗去覆盖物和甲醛，加入结晶紫染液后于室温孵育30 min，用水冲洗并晾干，计数噬斑形成单位（plaque forming unit，PFU）。根据公式计算滴度：病毒滴度（PFU/mL）=平均噬斑形成单位×稀释倍数/每孔接种体积（mL）。

1.8 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析和制图。实验结果以x¯±s表示，对数据进行正态性检验，符合正态分布的两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DENV感染后7种树鼩细胞发生显著病变

在DENV接种后观察的6 d（144 h）内，所有细胞均出现光学显微镜下可分辨的细胞病变，出现CPE的时间见表1。TSFs产生可分辨病变的时间最早，为感染后24 h；4种树鼩细胞TAECs、TASMCs、THs、pTRECs以及C6/36均于感染36 h出现病变；TCSCs以及2种常用细胞BHK-21、A549于感染48 h出现病变；TBMECs和Vero于感染60 h出现病变；而树鼩细胞TRMECs的病变始终不明显。

表1   登革病毒感染不同细胞后的细胞病变效应变化

Table 1  Changes of cytopathic effect (CPE) in different cell types after dengue virus (DENV) infection

细胞

Cell

接种后时间/h

Time post-infection/h

1224364860728496108120132144
TAECs--++++++++++++++++++
TASMCs--++++++++++++++++++
THs--+++++++++++++++
pTRECs-±++++++++++++++++++
TSFs±+++++++++++++++++++++
TCSCs--±++++++++++++++++++
TBMECs---±+++++++++++++++++
TRMECs---±±+++++
Vero---±+++++++++++++++
BHK-21---+++++++++++++++++++++++++
A549--±+++++++++++++++++++++++
C6/36--+++++++++++++++++++++++++

注：TSFs，树鼩皮肤成纤维细胞；pTRECs，原代树鼩肾上皮细胞；TAECs，树鼩主动脉内皮细胞；TASMCs，树鼩主动脉平滑肌细胞；THs树鼩肝细胞；TCSCs，树鼩角膜基质细胞；TBMECs，树鼩脑微血管内皮细胞；TRMECs，树鼩视网膜微血管内皮细胞；C6/36、Vero、A549及BHK-21细胞系作为阳性对照。未见CPE记为“-”；疑似CPE记为“±”；0%～25%CPE记为“+”；26%～50%CPE记为“++”；51%～75%CPE记为“+++”；76%～100%CPE记为“++++”。

Note： TSFs， tree shrew skin fibroblasts； pTRECs， primary tree shrew renal epithelial cells； TAECs， tree shrew aortic endothelial cells； TASMCs， tree shrew aortic smooth muscle cells； THs， tree shrew hepatocytes； TCSCs， tree shrew corneal stromal cells； TBMECs， tree shrew brain microvascular endothelial cells； TRMECs， tree shrew retinal microvascular endothelial cells； The C6/36， Vero， A549 and BHK-21 were used as positive control cells. CPE was graded as： -， no observable CPE； ±， suspected CPE； +， 0–25% CPE； ++， 26%–50% CPE； +++， 51%–75% CPE； ++++， 76%–100% CPE.

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5种树鼩细胞TAECs、TASMCs、THs、pTRECs和TSFs于感染72～84 h时病变达到最大，早于阳性对照细胞BHK-21（96 h）、A549（132 h）、C6/36（144 h）和Vero（144 h）；2种树鼩细胞TCSCs和TBMECs于108 h时病变程度达到最大，早于阳性对照细胞A549、C6/36和Vero。

2.2 DENV感染后7种树鼩细胞形态变化

在倒置显微镜下，树鼩细胞TAECs、TASMCs、pTRECs及TBMECs呈梭形或多角形，具有相似的CPE特征（图1）：在病变中期（51%～75%CPE），部分细胞变圆、脱落，导致胞间隙增大，细胞呈拉丝状，此后细胞快速大量脱落；在病变晚期（76%～100% CPE），少量仍贴壁的细胞呈细长梭形或不规则形，边缘粗糙、颗粒增多；TBMECs同时出现空泡化，最后全部脱落。而另外4种树鼩细胞的CPE不明显：THs呈圆形或多边形，发生病变的细胞变圆、脱落，可见细胞碎片，最终细胞碎片和死细胞黏附在底部残留的细胞骨架上；TSFs呈梭形，病变细胞快速裂解，呈剧烈拉丝状，虽然未感染TSFs也出现了拉丝状，但感染组明显更加严重；TCSCs呈梭形至多角形，病变细胞裂解或变圆脱落，平皿底部残留细胞骨架。TRMECs被感染后出现拉丝状，但未感染的TRMECs也出现拉丝，虽然感染组相较于未感染对照组产生更多细胞脱落和拉丝现象，但对比不明显。

图1

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图1   倒置显微镜下不同来源的树鼩细胞和阳性对照细胞感染登革病毒前后的形态学变化（×200）

注：TAECs为树鼩主动脉内皮细胞；TASMCs为树鼩主动脉平滑肌细胞；pTRECs为原代树鼩肾上皮细胞；THs为树鼩肝细胞；TBMECs为树鼩脑微血管内皮细胞；TCSCs为树鼩角膜基质细胞；TSFs为树鼩皮肤成纤维细胞；TRMECs为树鼩视网膜微血管内皮细胞；C6/36、Vero、A549及BHK-21作为阳性对照细胞。

Figure 1   Morphological changes in tree shrew cells of different tissues and positive control cells before and after dengue virus （DENV） infection under inverted microscope （×200）

Note： TAECs， tree shrew aortic endothelial cells； TASMCs， tree shrew aortic smooth muscle cells； pTRECs， primary tree shrew renal epithelial cells； THs， tree shrew hepatocytes； TBMECs， tree shrew brain microvascular endothelial cells； TCSCs， tree shrew corneal stromal cells； TSFs， tree shrew skin fibroblasts； TRMECs， tree shrew retinal microvascular endothelial cells； The C6/36， Vero， A549 and BHK-21 cells were employed as positive controls.


依照各种细胞的特点，DENV引起树鼩细胞发生的CPE类型可分为：①细胞变圆、脱落（见于本实验中所有细胞）；②细胞伸长、拉丝（见于TAECs、TASMCs、pTRECs、TBMECs和TSFs）；③细胞空泡化（见于TBMECs）；④细胞碎裂（见于THs和TCSCs）。以上结果表明，7种树鼩细胞感染DENV后产生了不同程度的CPE。

2.3 DENV感染后不同树鼩细胞的病毒载量

感染DENV后，每12 h采用实时荧光定量PCR法检测各种细胞培养物中的病毒载量，共4次。由图2可知，除TRMECs外，其他7种树鼩细胞对DENV均易感，而且在感染DENV后病毒载量呈先升后降的趋势，达到峰值后病毒载量水平能维持一段时间。

图2

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图2   实时荧光定量PCR检测感染不同来源的树鼩细胞后登革病毒的增殖曲线

注：TAECs，树鼩主动脉内皮细胞；TASMCs，树鼩主动脉平滑肌细胞；THs树鼩肝细胞；pTRECs，原代树鼩肾上皮细胞；TSFs，树鼩皮肤成纤维细胞；TCSCs，树鼩角膜基质细胞；TBMECs，树鼩脑微血管内皮细胞；TRMECs，树鼩视网膜微血管内皮细胞；C6/36、Vero、A549及BHK-21作为阳性对照细胞。

Figure 2   Viral proliferation curves of tree shrew cells of different tissues after dengue virus （DENV） infection via real-time fluorescent quatitative PCR

Note： TAECs， tree shrew aortic endothelial cells； TASMCs， tree shrew aortic smooth muscle cells； THs， tree shrew hepatocytes； pTRECs， primary tree shrew renal epithelial cells； TSFs， tree shrew skin fibroblasts； TCSCs， tree shrew corneal stromal cells； TBMECs， tree shrew brain microvascular endothelial cells； TRMECs， tree shrew retinal microvascular endothelial cells； The C6/36， Vero， A549 and BHK-21 cells were employed as positive controls.


各种细胞感染后病毒载量达到峰值的时间见表2，树鼩细胞中pTRECs的病毒载量最高（9.18×107拷贝/μL），最接近阳性对照细胞C6/36和Vero的病毒载量，其次为TBMECs（7.43×107拷贝/μL）、TASMCs（7.27×107拷贝/μL）、TAECs（6.87×107拷贝/μL）和THs（4.08×107拷贝/μL），这5种树鼩细胞的病毒拷贝数均高于4×107拷贝/μL，处于阳性对照细胞峰值载量最高值（Vero）和最低值（A549）之间。

表2   各种细胞感染后病毒载量峰值及达到峰值的时间

Table 2  Peak viral load and time-to-peak in different cell types after dengue virus (DENV) infection

细胞

Cell

病毒载量峰值/（拷贝·μL-1）

Peak viral load/ (copies·μL-1)

时间/h

Time/ h

pTRECs(9.18±0.21)×10748
TBMECs(7.43±0.75)×10772
TASMCs(7.27±0.43)×10784
TAECs(6.87±0.30)×10772
THs(4.08±0.02)×10748
TCSCs(1.11±0.05)×10736
TSFs(1.50±0.05)×10684
Vero(1.39±0.22)×108120
C6/36(1.28±0.21)×108120
BHK-21(6.73±0.13)×10748
A549(1.13±0.05)×10760

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2.4 不同树鼩细胞的DENV滴度

检测病毒感染性的噬斑实验结果见图3，噬斑区为不染色区域，斑块较大、轮廓较清晰，可用于噬斑计数。选择10-4和10-5这2个病毒液稀释度，每个稀释度设2个重复孔，即共4个孔进行计数，然后计算病毒滴度。5种树鼩细胞均可产生感染性子代病毒，其中TAECs中增殖的DENV滴度最高［（3.13±0.61）×105 PFU/mL］，接近于阳性对照细胞C6/36［（3.85±1.95）×105 PFU/mL］；其次为THs［（2.03±0.68）×105 PFU/mL］、pTRECs［（1.58±0.66）×105 PFU/mL］，与阳性对照细胞C6/36相比明显降低（P＜0.05）；TASMCs中DENV滴度为［（1.03±0.05）×105 PFU/mL］，TBMECs中DENV滴度为［（0.29±0.14）×105 PFU/mL］，均显著低于阳性对照细胞（P＜0.01）。

图3

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图3   噬斑实验测定不同树鼩细胞中登革病毒的病毒滴度

注：A，C6/36细胞中DENV增殖所形成的斑块；B，TAECs中DENV增殖所形成的斑块；C，TASMCs中DENV增殖所形成的斑块；D，THs中DENV增殖所形成的斑块；E，pTRECs中DENV增殖所形成的斑块；F，TBMECs中DENV增殖所形成的斑块。C6/36细胞作为阳性对照；红圈指示噬斑；10-3、10-4、10-5表示病毒液稀释倍数；control表示未感染病毒的对照孔。

Figure 3   Quantification of dengue virus （DENV） titer in tree shrew cells of different tissues via plaque assay

Note： A， Plaques formed by DENV proliferating in C6/36 （positive control）； B， Plaques formed in tree shrew aortic endothelial cells （TAECs）； C， Plaques formed tree shrew aortic smooth muscle cells （TASMCs）； D， Plaques formed in tree shrew hepatocytes （THs）； E， Plaques formed by DENV proliferating in primary tree shrew renal epithelial cells （pTRECs）； F， Plaques in primary tree shrew brain microvascular endothelial cells （TBMECs）. The C6/36 cells were employed as the positive control. Red circles demarcate individual plaques. Viral dilutions are indicated as 10-3， 10-4， and 10-5. The “control” denotes uninfected wells， serving as a negative reference.


3 讨论

已知DENV感染伊蚊后，首先在肠道中进行复制，进而被转运到唾液腺。在伊蚊叮咬人的过程中，病毒通过唾液被接种到皮肤的真皮层（少量释放入血），被皮下组织的单核细胞吞噬，传播至单核-巨噬细胞系统，病毒增殖后进入血液，引起病毒血症；随后病毒在组织的网状内皮系统和淋巴组织中增殖，再次入血引起病毒血症［19］。DENV可通过多种途径引起复杂多样的临床症状。研究表明，DENV与抗体形成的免疫复合物以及病毒NS1蛋白介导可引起血管通透性增加和凝血系统障碍，从而导致多种组织器官的血浆渗漏、出血；重症登革热可导致休克、肝损伤、肾损伤、神经系统并发症、眼病、横纹肌溶解等多个器官系统受累［16，20］。然而，重症登革热的具体机制至今未完全阐明。现有研究认为，多种因素如细胞因子风暴、抗体依赖性增强效应、病毒变异等均参与了DENV的致病过程［21-22］。

DENV感染易感细胞后引起细胞病变是构成感染的直接标志，同时细胞内的信号转导途径发生变化，从而导致了可从组织学、免疫组织化学、分子水平等各种方法检测的感染表征［23］。这些表征是理解病毒与细胞互作机制的基础，也是体内实验的重要参考。据文献报告，常用于DENV体外研究的非洲绿猴肾细胞Vero对多种病毒易感是因为干扰素基因表达缺陷［24］，虽然其获得了广谱病毒易感性，也可能由于无IFN-Ⅰ的环境而忽略了病毒在与宿主免疫系统互作时的某些关键适应机制，或放大了药物的有效性，因此限制了该细胞在某些病毒感染机制研究中的应用。另外两种常用的幼蚊细胞C6/36和叙利亚仓鼠肾细胞BHK-21因物种亲缘关系与人较远，在机制研究中不具有明显优势。因此，需要在与人类亲缘关系近的物种中寻找合适的细胞，以帮助研究者理解DENV感染、致病机制和跨物种传播风险。

细胞基质是病毒增殖的基础，其质量直接影响后续产品的质量和安全性。世界卫生组织（WHO）和我国国家药品监督管理局对生产人用疫苗和其他生物制品的细胞基质有着明确的要求［11］。建立新的细胞基质是一项复杂的工作，目前认可并广泛使用的只有少数几种细胞，其中使用最多的Vero细胞被WHO推荐为可靠和安全的疫苗生产首选细胞系［25-26］。然而，有研究表明，Vero细胞传代次数超过150代次时，可能具有潜在致瘤风险和遗传不稳定性［27］。由于现有细胞系尚不能满足所有标准和需求，因此有必要评估和对比不同细胞系以开发新的细胞基质。

树鼩与人类遗传相似性高，是值得研究的对象之一。本研究发现多种树鼩细胞在体外感染DENV后可出现明显的CPE，在这些树鼩细胞上观察到的细胞病变现象也出现在感染DENV的人源细胞上。皮肤是DENV的重要靶器官，大多数皮肤损害在早期出现，表现为全身皮肤出现充血性皮疹或点状出血疹［28］。体外感染的TSFs容许DENV的复制，在人源真皮成纤维细胞上也观察到了一致的结果［29］，表明成纤维细胞可能是与DENV互作的细胞之一。

已报告的重症登革热患者中常伴有肝肾损伤，这是导致死亡或长期影响的因素之一，可能由多种机制共同作用而引发［30］。感染DENV后THs和pTRECs表现出明显而快速的CPE，THs早期细胞脱落速度慢，晚期脱落明显加快，在人源肝细胞株HepG2和Hep3B细胞中也能观察到这一现象［31］，提示可能存在相同的细胞死亡途径。

树鼩不同血管来源的内皮细胞TAECs、TBMECs、TRMECs感染DENV后表现各异，表明不同来源的内皮细胞可能由于存在异质性而对DENV具有不同易感性。登革热患者和尸检报告中大动脉相关的病变较罕见［32］，然而主动脉来源的TAECs在3个血管内皮细胞中对病毒的容许性最高，病变最快；主动脉另一细胞成分TASMCs也显示高度敏感性，也有研究报告了人源脐动脉平滑肌细胞对DENV的容许性［33］，提示需关注DENV感染患者主动脉的隐匿风险。TBMECs感染DENV后发生明显CPE，类似地，人BMECs感染DENV-3也引起病变［34］，共同提示脑微血管内皮可能作为病毒入侵神经系统的途径。

DENV感染可引起多种眼部症状，包括视网膜出血、黄斑水肿和血管炎等［35-36］。本研究中，TCSCs感染DENV后引起该细胞病变和较高水平病毒复制，提示病毒可能在体内直接感染角膜组织，从而引起病变；DENV在TCSCs中产生细胞病变的速度早于Vero细胞，这与丁相荣等［15］的研究结果一致。然而，本研究发现，DENV在TRMECs上似乎没有复制，细胞病变水平也相对较低，但病毒增殖情况也可能受细胞状态等多种因素的影响，因此还需进一步探索。

综上，本研究选择的8种树鼩细胞中，有7种细胞（TAECs、TASMCs、THs、pTRECs、TSFs、TCSCs和TBMECs）发生了可明确辨别的CPE，表现出差异的敏感性和不尽相同的病变特征，且与相应的人源细胞和病例报告在某些方面相符合。同样地，病毒增殖的分子水平检测结果也提示这7种树鼩细胞能够支持DENV复制和感染，而且病毒拷贝数随感染时间而升高；其中5种树鼩细胞pTRECs、TBMECs、TASMCs、TAECs和THs与阳性对照细胞相当，均能产生感染性子代病毒；3种树鼩细胞TAECs、THs、pTRECs与阳性对照细胞C6/36的子代病毒滴度相当。本研究结果表明，树鼩细胞具有作为DENV感染机制研究和抗病毒药物开发工具的潜力，它们可能也是DENV在树鼩体内的感染位点。值得注意的是，相较于常用的Vero和BHK-21细胞，树鼩细胞生长速度更快，对病毒感染更敏感，DENV感染树鼩细胞后更早达到75%～80% CPE（尤其是TAECs、pTRECs、THs），且产生的病毒载量和滴度噬斑数达到了常用细胞系水平，因此在病毒制备时能够兼顾病毒产量和生产效率。

综上所述，本研究选择的7种树鼩细胞对DENV均具有易感性，其中pTRECs、TAECs、THs是发展为DENV病毒培养工具的潜力细胞。同时本研究提示，这些树鼩细胞来源的体内组织器官可能是DENV感染的致病部位，建议研究人员在整体动物造模时应关注这些组织器官。

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作者贡献声明

刘欣负责实验方法设计、结果可视化和初稿写作；

杞梦迪、王文广负责提供资源，参与有效验证或监督指导；

罕园园负责监督指导、写作审编；

陆美丽、李娜参与有效验证或研究项目管理；

代解杰负责研究方案策划、方法设计、监督指导和论文修订；

陆彩霞负责获取项目资助和管理，以及实验监督指导。

利益冲突声明

所有作者均声明本文不存在利益冲突。

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