随着医疗技术的进步和生活水平的提高，人类平均寿命显著延长，老龄人口视力障碍问题日益突出。据统计，我国50岁以上人群中，中重度视力障碍的患病率为10.8%，失明率为2.29%^［1］。老龄人群的视力障碍多与眼球内部结构病变密切相关，例如：青光眼与视网膜神经节细胞变性及凋亡相关，老年性黄斑变性则与视网膜色素上皮细胞衰老及功能衰退相关，而白内障主要由晶状体蛋白质变性引发^［2-4］。由于人类眼球样本获取困难，而实验动物（尤其是啮齿类动物）符合科研伦理规范、成本可控，且与人类眼球结构有一定的相似性，成为研究眼部疾病机制的理想模型。因此，基于啮齿类动物开展实验探究眼球内部结构与功能变性机制，可为眼科疾病的防治提供重要理论依据。

在眼科疾病及其相关动物模型的研究中，眼球病理标本的制备至关重要。组织处理是制作病理标本的关键步骤，其目的在于通过化学固定防止组织细胞自溶与腐败，并借助化学交联（如使蛋白质交联变性）、沉淀（如保存糖原）等方式，最大程度地稳定细胞内的大分子物质（主要是蛋白质和核酸）及关键结构成分，使样本尽可能接近在体的形态学特征^［5］。然而，由于角膜、晶状体、视网膜等眼球内部结构在组织结构、硬度和收缩特性方面存在显著差异，固定过程中易出现组织分离、断裂等人工假象，严重影响后续切片制作和病理学诊断的可靠性^［6］。此外，目前常用的固定液均存在一定的局限性，如多聚甲醛固定液会导致眼球组织严重收缩，Bouin固定液和Verhoeff固定液中所含的苦味酸毒性高且易爆。因此，开发兼具优异固定效果和高安全性的新型固定液具有重要意义。本研究团队在前期研究中研制了一种新型眼球专用固定液，本研究在相同制片条件下，将其与体积分数为10%的甲醛固定液、戊二醛-甲醛混合固定液及改良Davidson固定液进行对比分析，系统评估该固定液对大鼠角膜、晶状体和视网膜等眼球关键结构的固定效果，旨在为眼科病理学研究提供更优的实验方法。

5周龄SPF级雄性SD大鼠20只，体重150～170 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（浙）2024-0001］，质量合格证号为20250106Aazz0619000124336280。动物饲养于上海中医药大学新药安全评价中心动物屏障设施［SYXK（沪）2020-0009］，室温（22±2）℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗交替。动物房提供实验动物反渗透饮用水和钴⁶⁰辐照饲料（购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司）。所有实验操作均经过上海中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（审批号PZSHUTCM220926006），遵循实验动物伦理规范和相关法律法规，确保动物福利和实验的科学性。

分析纯戊二醛（批号3092836）、分析纯二甲苯（批号3242854）、分析纯无水乙醇（批号3124197）、分析纯冰醋酸（批号1875839）、分析纯丙酮（批号01104445）和0.01 mol/L PBS（pH=7.2，批号A7353A DDB）均购自上海泰坦科技股份有限公司；分析纯甲醛（批号20230511）购自国药集团化学试剂有限公司；苏木精（批号241009）和伊红（批号250102）染液均购自珠海贝索生物技术有限公司；舒泰™50（批号968AA）购自维克贸易（上海）有限公司。全封闭组织脱水机（型号VIP-5）购自日本樱花医疗集团；石蜡包埋机（型号HistoStar）和轮转式组织切片机（型号RM2235）购自德国Leica仪器有限公司；自动染色机（型号HD-400i）购自宁波察微生物科技有限公司。

（1）10%甲醛固定液：将甲醛原液（37%～40%）和纯净水按1∶9体积比混合。（2）戊二醛-甲醛混合固定液：分别配制A液（0.01 mol/L PBS，pH=7.2）、B液（将0.01 mol/L PBS与甲醛原液按9∶1体积比混合，pH=7.2）和C液（将0.01 mol/L PBS与50%戊二醛按3∶2体积比混合，pH=7.2），使用时将A液、B液和C液按2∶1∶1体积比混合。（3）改良Davidson固定液：将无水乙醇、甲醛原液、冰醋酸和纯净水按3∶6∶1∶10体积比混合。（4）自研固定液：分别配制A液（0.01 mol/L PBS，pH=7.2）、B液（将0.01 mol/L PBS与甲醛原液按9∶1体积比混合，pH=7.2）和C液（将0.01 mol/L PBS与50%戊二醛按3∶2体积比混合，pH=7.2），使用时将A液、B液、C液、D液（冰醋酸）和E液（丙酮）按10∶10∶10∶3∶6体积比混合。以上固定液配制后置于冰箱4 ℃保存（保质期约90 d），于解剖大鼠摘取眼球前取出使用。

将20只SD大鼠随机分为4组，分别为10%甲醛组、戊二醛-甲醛组、改良Davidson固定液组和自研固定液组。通过腹腔注射舒泰™50（45 mg/kg）对大鼠进行麻醉，待大鼠完全麻醉后，把其仰卧位置于解剖板上，用绳子固定四肢；沿大鼠腹部中线剪开皮肤，用干棉球轻轻拨开腹部脂肪，暴露腹主动脉；剪断腹主动脉，采用放血法使大鼠安乐死。待血流尽、大鼠眼球发白后，沿眼眶完整摘取双侧眼球，保留约2 mm视神经，不作切开处理。按照分组顺序连续摘取眼球，每组共10只眼球样本，分别浸泡于相应的固定液中，每组固定液的体积均为50 mL，室温固定72 h。

固定结束后，沿视神经纵向切开眼球，保留视神经部分，对眼球进行常规制片。将眼球组织依次浸入95%乙醇30 min、100%乙醇Ⅰ～Ⅳ各60 min进行梯度脱水；依次浸入二甲苯Ⅰ～Ⅲ各60 min透明；依次浸入石蜡Ⅰ～Ⅳ各60 min浸蜡。浸蜡结束后，把眼球水平切面朝下放入包埋盒中，再将63 ℃液体石蜡注入包埋盒，待蜡块冷却凝固后取出，室温保存备用。

使用轮转切片机进行切片，厚度为3 μm，眼球切片于46 ℃水浴中展平后，平放在展片机上展片，随后在50 ℃烘箱里过夜烘干。将眼球切片依次置于二甲苯Ⅰ～Ⅲ各5 min脱蜡；随后置于100%乙醇Ⅰ～Ⅲ各2 min、75%乙醇Ⅳ 1 min进行梯度水化，用自来水冲洗2 min。将水洗后的切片放入苏木精染液中染色15 min，随后用自来水冲洗8 min；放入1%盐酸乙醇溶液中分化5 s，接着用自来水冲洗2 min；最后置于伊红染液中染色3 min。切片经伊红染色后，在自来水中快速漂洗3 s，随后依次浸入75%乙醇Ⅰ3 s、100%乙醇Ⅱ10 s、100%乙醇Ⅲ 30 s脱水，二甲苯Ⅳ 30 s、二甲苯Ⅴ 1 min、二甲苯Ⅵ 2 min透明。透明后取出切片，用中性树胶封片。

（1）眼球的整体形态与收缩程度：观察固定后眼球的整体形态是否保持圆润，是否存在收缩、变形或凹陷现象。（2）角膜的完整度：评估角膜各层结构（上皮层、基质层、内皮层）的完整性，观察是否存在断裂、褶皱或细胞排列紊乱的现象。（3）晶状体的完整度：检查晶状体的形态是否完整，观察赤道、皮质及核区是否存在裂痕、破碎或脱片现象。（4）视网膜各层细胞的清晰性与分离程度：评估视网膜各层细胞（如神经节细胞层、感光细胞层、双极细胞层等）的排列是否整齐，染色是否清晰；观察视网膜与脉络膜/巩膜层的连接是否紧密，是否存在分离、断裂现象。评估参数由两名病理诊断人员独立阅片、客观分析后汇总评判，分值范围为0～4分，代表不同的病理损伤程度，分值越高表示损伤越严重。参考文献^［7］制定本研究的评分标准，具体评分标准见表1。

采用SPSS 22.0统计软件对评分结果进行处理和分析，数据以x¯±s表示。首先对数据进行正态性检验和方差齐性检验（Levene检验）。若数据符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析进行统计学比较；若差异有统计学意义，采用Dunnett T3检验。方差不齐时，采用Kruskal-Wallis H秩和检验进行统计分析；若差异有统计学意义，则采用Mann-Whitney U秩和检验进行组间比较。若数据不符合正态分布，采用非参数检验（Mann-Whitney Test）。P<0.05表示差异有统计学意义。

经过固定、脱水、包埋、切片和HE染色后，于12.5倍光学显微镜下观察各组大鼠眼球的整体形态和组织结构，结果显示4组切片间存在明显差异（图1、表2）。其中，经10%甲醛固定的10只眼球均出现眼球壁皱缩和凹陷现象；视网膜大面积分离并断裂；晶状体大体保持完整，无明显破裂，角膜可见裂隙（图1A）。经戊二醛-甲醛固定的10只眼球中有8只出现不同程度的收缩变形，余下2只眼球收缩程度较轻；视网膜出现分离和断裂现象；晶状体结构完整、无破裂，角膜完整（图1B）。经Davidson固定的10只眼球形态圆润，未见收缩或变形；视网膜完整，无分离或断裂现象；但晶状体明显破碎，完整性较差，角膜见明显裂隙（图1C）。经自研固定液固定的10只眼球形态圆润，未见收缩或变形；视网膜完整，未见分离或断裂现象；晶状体基本保持完整，无破裂；角膜见明显裂隙（图1D）。

在400倍光学显微镜下观察各组大鼠眼球HE染色后的角膜形态变化，结果如图2和表3所示。其中，经10%甲醛固定的眼球角膜基质层可见不连续断裂现象，胶原板层细胞排列褶皱不规则，结构完整性较差；复层扁平上皮细胞染色较戊二醛组浅，分层清晰，内皮层细胞排列整齐无裂隙。细胞核和细胞质的对比度较低。经戊二醛-甲醛固定的大鼠眼球角膜基质层结构完整，细胞排列整齐，未见断裂或褶皱现象；上皮层细胞染色清晰，细胞核和细胞质对比明显，内皮层细胞排列整齐，各层结构紧密，整体形态保持良好，但基质层连同上皮层整体过于致密。经改良Davidson固定液固定的大鼠眼球角膜基质结构完整性最差，可观察到连续的组织断裂；上皮层细胞核染色较淡，细胞质与细胞核的对比度较低；内皮层染色浅，但未见断裂。经自研固定液固定的大鼠眼球角膜基质层结构呈规则性断裂，完整性不足，有褶皱现象；上皮层细胞染色清晰，细胞核和细胞质对比明显；内皮层未见断裂，排列整齐。各组眼球角膜的评分情况见表4：改良Davidson固定液组（10/10，100%）和10%甲醛组（6/10，60%）主要集中在3分（中度）和4分（重度）；戊二醛-甲醛组（10/10，100%）全部集中在0分（正常）和1分（轻微）；自研固定液组（10/10，100%）分布与改良Davidson固定液组和10%甲醛组类似，集中于3分（中度）和4分（重度）。与改良Davidson固定液组相比，10%甲醛组和戊二醛-甲醛组的固定效果优异。

在40倍光学显微镜下观察各组大鼠眼球HE染色后晶状体的形态变化，结果如图2和表3所示。经10%甲醛固定的大鼠眼球晶状体赤道和皮质部位均出现了不同程度的裂痕，但晶状体纤维结构保持完整，未观察到明显的破裂或脱片现象，细胞间有裂隙，晶状体染色鲜艳。经戊二醛-甲醛固定的大鼠眼球晶状体赤道部位有轻微裂痕，其余部位结构均保持完整，无破损或脱片现象，细胞整齐无裂隙，晶状体染色鲜艳。经Davidson固定的大鼠眼球晶状体均出现明显的大面积破裂和脱片现象，各部位（赤道、皮质、核区）结构几乎被完全破坏，无法观察到完整的晶状体形态，细胞间有裂隙，染色深。经自研固定液固定的大鼠眼球晶状体外围部位有轻微红色褶皱，细胞整齐无裂隙，其余部位结构均保持完整，染色鲜艳，无破损或脱片现象。各组眼球晶状体的评分情况见表4：戊二醛-甲醛液组（7/10，70%）与自研固定液组（8/10，80%）的损伤程度最轻，绝大多数眼球集中在0分（正常）和1分（轻微）；改良Davidson固定液组（10/10，100%）所有样本均在4分（重度）；10%甲醛组（9/10，90%）的固定效果不均，大部分处于2分（轻度）和3分（中度）。与改良Davidson固定液组相比，另外3组固定液的固定效果良好，其中自研固定液效果最好。

在400倍光学显微镜下观察各组大鼠眼球HE染色后的视网膜形态学变化，观察结果如图2和表3所示。经10%甲醛固定的视网膜与脉络膜/巩膜层严重分离，视网膜组织大面积断裂，形态完整性缺失；各细胞层存在大面积裂隙，细胞染色鲜艳，但染色效果差，细胞核与细胞质对比不清，无法辨清细胞层次。经戊二醛-甲醛固定的视网膜与脉络膜/巩膜层明显分离，但各层细胞染色鲜艳，细胞排列整齐、层次清晰；最内层的神经纤维层出现分离和肿胀现象；部分眼球的外网层出现破碎和分离；整体视网膜结构仍保持相对完整。经Davidson固定的视网膜各层细胞结构完整，排列整齐、无断裂现象；细胞核和细胞质染色清晰、对比明显，内界膜、神经纤维层、节细胞层、内网层、内核层、外网层、外核层、外界膜、光感受器层、视网膜色素上皮层和脉络膜各层结构层次分明，细胞染色较淡，整体固定效果较好。经自研固定液固定的视网膜各层细胞结构完整、无断裂，排列整齐；细胞核和细胞质染色清晰、对比明显，染色颜色鲜艳，视网膜形态和细胞结构均保持良好。各组眼球视网膜的评分情况见表4：改良Davidson固定液组（10/10，100%）和自研固定液组（10/10，100%）的视网膜评分集中在0分（正常）和1分（轻微）；10%甲醛组（10/10，100%）均在3分（中度）和4分（重度）；戊二醛-甲醛组效果不稳定，评分分散（2～4分，轻微～重度）。与改良Davidson固定液组相比，戊二醛-甲醛组和10%甲醛组的固定效果明显较差，自研固定液组无显著差异。

各组眼球不同部位的形态学观察统计结果显示（表5）：在角膜结构中，戊二醛-甲醛的固定效果明显好于其余3组；在晶状体结构中，改良Davidson固定液的固定效果最差，自研固定液和戊二醛-甲醛固定液的固定效果最好；在视网膜结构中，改良Davidson固定液和自研固定液的固定效果最佳。

在眼科病理研究中，固定液的选择是影响组织切片质量的关键因素。固定液的化学成分、pH值及固定时间等参数均会影响组织固定效果，从而进一步影响后续实验的可靠性^［8］。若选用不适宜的固定液或固定时间不足，可能引发视网膜层间分离等人工假象，不仅会降低组织制片的结构完整性、影响特定染色的显色效果，更可能损害病理诊断的准确性，并对相关科学研究结论的有效性造成干扰。体积分数为10%的甲醛溶液因其优异的组织固定特性，在病理学研究中应用广泛。该固定剂分子可与蛋白质中的多种氨基酸（如赖氨酸、精氨酸等）发生交联反应，具有渗透性强、固定均匀的特点，对多数组织脏器的收缩效应较小，能较好地保持组织弹性^［9］。然而，本研究观察到，眼球样本在10%甲醛固定液中固定约2 h后即出现明显的收缩和塌陷。在固定结束后切开眼球，发现视网膜与脉络膜/巩膜层、肌肉层结构松散，已呈现分离趋势。实验结果显示，所有经甲醛固定的眼球均出现明显的整体收缩，角膜基质层可见断裂，晶状体大体结构基本完整，视网膜出现层间分离及碎片化等严重病理假象。本研究认为，可能是眼球壁结构致密，甲醛难以迅速渗透至眼球内部，导致内外固定不均，从而引起结构塌陷。此外，后续病理制样过程中使用的乙醇、二甲苯等有机试剂进一步加剧了视网膜结构的剥离。上述结果表明，单一使用甲醛溶液难以满足眼球组织的理想固定要求。

戊二醛-甲醛混合固定液由戊二醛、甲醛及PBS按特定比例配制而成。实验结果显示，该混合固定液对角膜和晶状体的固定效果良好。其优势主要源于甲醛的快速均匀渗透能力与戊二醛的双醛基结构的协同作用：戊二醛可与蛋白质中的氨基、巯基等基团形成更广泛的交联网络，从而更有效地稳定细胞的超微结构^［10-11］。两者联合使用可显著提升固定效果，减少晶状体的收缩变形。在本研究中，该混合固定液是4组固定液中唯一能良好保持角膜结构的固定液。然而，从眼球整体观察来看，所有样本均出现明显收缩和皱褶，视网膜也普遍存在层间分离现象。这主要是由于眼球壁组织结构的异质性：视网膜为薄层脆弱的神经组织，中间的脉络膜富含血管和胶原蛋白网络，而外层的巩膜则由致密的胶原纤维组成。各层间的结构和成分差异导致它们在固定过程中收缩程度不一致，进而引发视网膜层间分离。因此，尽管戊二醛-甲醛混合固定液在角膜和晶状体中显示出良好的固定效果，但对维持眼球整体形态及保持视网膜结构方面仍存在一定的局限性。

改良Davidson固定液是一种由乙醇、冰醋酸和甲醛组成的复合固定液，其独特配方通过各组分的协同作用实现固定效果的优化。实验结果显示，经该固定液处理后的眼球整体形态保持圆润，视网膜结构完整、无断裂，细胞层次清晰可辨。这一性能可归因于各组分的功能互补：甲醛提供基础交联固定作用；冰醋酸具有组织膨胀效应及双亲性（兼具亲水性和亲脂性），可显著提高固定液在组织中的渗透速率与组织均匀性^［12］；而乙醇则通过脱水作用抵消由冰醋酸引起的过度膨胀^［13-15］，从而在维持眼球形态的同时，保障视网膜结构的完整性。然而，该固定液也表现出一定的局限性。所有样本的角膜基质层均出现明显断裂，可能与其中富含的胶原纤维和糖胺聚糖对酸性环境较为敏感有关。有研究指出，冰醋酸可破坏胶原纤维的稳定性^［16］，导致基质结构松散。此外，固定后的晶状体硬度较高，切片中可见不同程度的破碎或脱片，推测酸性条件引起晶状体蛋白构象改变、聚集沉淀，从而增加了组织脆性^［17］。综上所述，改良Davidson固定液虽能够较好地维持眼球整体形态并实现视网膜的有效固定，目前已被广泛应用于实验室及工业场景中，但仍不适用于以晶状体或角膜为重点研究对象的组织固定工作。

基于上述常用固定液的局限性，本研究团队开发了一种新型复合眼球固定液。该固定液在戊二醛-甲醛体系的基础上，创新性地引入了冰醋酸与丙酮作为功能性调节组分。实验结果显示，经该固定液处理后的眼球形态保持圆润，未出现明显收缩或变形；晶状体结构明显软化，并可完整切片；视网膜亦保持完整，未发生层间分离或断裂。这一改善主要归因于丙酮的独特调控作用。作为一种极性有机溶剂，丙酮兼具脂溶性与强脱水能力：一方面可溶解晶状体纤维细胞的脂质双分子层，显著增加膜通透性^［18-20］；另一方面通过破坏晶状体蛋白的水合层，促使细胞内蛋白发生沉淀，形成致密的“蛋白凝胶”^［21-22］。在此基础上，戊二醛-甲醛体系通过高效交联将细胞内容物（如线粒体、溶酶体内质网等）稳固于细胞内，从而实现对细胞的良好固定作用。此外，由于晶状体纤维细胞的脂质膜被溶解，石蜡可以快速浸入细胞间隙，为脱水后的组织蛋白提供足够的硬度和支撑力，使得切片时晶状体不易碎裂^［23］，从而实现整体“软化”效果。三者的协同作用显著提升了固定液对组织的固定质量。尽管如此，该固定液仍存在一定局限：所有样本的角膜基质层仍可见明显裂隙，推测是配方中冰醋酸成分对胶原结构的破坏作用所致。

综合上述的系统性评估结果，4种固定液中，改良Davidson固定液和自研固定液均能良好维持眼球整体形态，固定后眼球保持圆润且无明显收缩。当需要对角膜进行研究时，推荐使用戊二醛-甲醛固定液；当需要对晶状体与视网膜同时进行研究时，更推荐使用本研究研制的固定液，而不建议采用目前实验室常用的改良Davidson固定液。传统的10%甲醛固定液会导致明显的眼球收缩和视网膜分离，不建议用于眼球组织固定。

在将本实验结果推广至不同种属实验动物眼球固定时，本研究结论仍具有参考价值。对于小鼠、豚鼠等啮齿类动物，因动物体型差异不大，且其眼球在角膜厚度、晶状体形态及视网膜层次结构等方面与大鼠高度相似^［24］，本固定液具备良好的可推广性。然而，对于比格犬、食蟹猴等非啮齿类动物，由于体型差异大，且其眼球体积显著大于大鼠，外膜结构也更厚，需根据其组织特性对固定液的配比和成分进行相应调整，以实现更理想的固定效果。

唐小杭, 谷颖敏, 吕阳阳, 等. 一种自研固定液用于制备大鼠眼球切片的组织学染色效果评价[J]. 实验动物与比较医学, 2026, 46(2): 261-270. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.083.

TANG X H, GU Y M, LÜ Y Y, et al. Evaluation of the histological staining performance of rat eyeball sections prepared using a self-developed fixative[J]. Lab Anim Comp Med, 2026, 46(2): 261-270. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.083.