无胸腺裸小鼠作为一种免疫缺陷动物， 是目前生物医药领域常用的实验动物模型。裸小鼠鳞状皮肤病是一种全身性角化过度皮炎，典型的临床症状表现为全身皮肤出现白色鳞状皮屑^［1］。牛棒状杆菌通常被认为是引起该症状的病原体^［2-3］。但是，有临床诊断病例提示感染木糖葡萄球菌也可引起同样的临床症状^［4］。木糖葡萄球菌是一种寄居在哺乳动物皮肤的条件致病性共生菌，但其对免疫缺陷和基因敲除的小鼠表现出明显的致病性^［5］，症状为皮炎和脓肿等^［6-9］，在这些小鼠的皮肤样本中均可分离到该菌。因此，木糖葡萄球菌被认为是免疫缺陷和基因敲除小鼠的潜在机会性病原体^［10］。

笔者所在检测室于2023年8月接收到一只临床症状为鳞状皮屑的BALB/c 裸小鼠，经核酸检测排除牛棒状杆菌感染后，对该裸小鼠病灶区皮肤样本进行病原分离鉴定、全基因组测序、动物感染试验和组织病理学检测等研究，判断其感染病原为木糖葡萄球菌，并进一步探讨该菌对裸小鼠的致病性，以期为鳞状皮屑裸小鼠的病原体诊断提供更广阔的思路。

1只患鳞状皮屑皮肤病的裸小鼠来自上海实验动物研究中心质监站的日常检测，对其患病皮肤进行无菌棉拭子采样，用于病原体诊断。

用于动物感染试验的15只雄性BALB/c裸小鼠均8周龄，购自上海必凯科翼生物科技有限公司［SCXK（沪）2023-0009］， 饲养在上海实验动物研究中心屏障设施［SYXK（沪）2019-0003］ 。环境温度为20～24 ℃，相对湿度为45%～55%，饲料 、水 、垫料和笼盒等均经高压蒸汽灭菌，动物自由采食，光照采取12 h/12 h昼夜交替。本实验方案通过上海实验动物研究中心实验动物福利伦理审查委员会审查批准（PA202303201），全程严格遵循3R原则。

32通道全自动核酸纯化仪及配套的磁珠法核酸提取试剂均购自麦诺迪（上海）生物科技有限公司；全自动微生物鉴定系统 （VITEK2 Compact）购自法国Biomerieux公司；荧光定量PCR仪（型号CFX Opus 96）购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR反应液 TaqManTM Gene Expression Master Mix（批号 2654759）购自美国ABI公司； 高盐甘露醇琼脂平板（批号20230801）和血琼脂平板 （批号 20230808）均购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；革兰染色试剂（批号230109）购自杭州滨和微生物试剂有限公司。生物荧光显微镜（型号Imager A1）购自德国Carl Zeiss公司。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

将鳞状皮屑皮肤患处采集的拭子样本置于2 mL离心管中，加入1 mL无菌生理盐水，浸泡5～10 min后振荡30 s，取200 μL菌悬液进行全基因组DNA提取。按照32 通道全自动核酸纯化仪及配套的磁珠法核酸提取试剂说明书操作。

采用中国实验动物学会团体标准T/CALAS 20—2017推荐的实时荧光定量PCR法^［11］检测牛棒状杆菌。PCR扩增上游引物序列为5´-CGGCAGGGACGAA-GCTT-3´，下游引物序列为5´-CACGTAGTTAGCCG-GTGCTTCT-3´，探针序列为FAM-TGTGACGGTAC-CTGCAT-MGB。引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。以牛棒状杆菌扩增片段的重组质粒作为阳性对照，以牛棒状杆菌阴性正常小鼠的皮肤组织DNA为阴性对照。

按中国实验动物学会团体标准T/CALAS 92—2020推荐方法^［12］进行木糖葡萄球菌的常规分离培养。用无菌棉拭子蘸取生理盐水后，刮取鳞状皮屑，将拭子涂在高盐甘露醇琼脂平板，36 ℃培养24 h，观察菌落生长结果。挑取直径为（1.0±0.5）mm，表面光滑，呈白色圆形凸起，周围有晕环的疑似菌落，在血琼脂平板上进行单菌落培养，36 ℃培养24 h后，按革兰染色试剂说明书推荐步骤进行革兰细菌染色。用生物荧光显微镜（1 000倍）观察视野内菌落形成情况。

收集纯培养的菌落，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行菌种鉴定。用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行菌落基因组提取。以16S rDNA通用扩增引物27F（5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´）和1492R（5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´）进行PCR扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl₂ 2 μL，2 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L的27F和1492R引物各1 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，基因组DNA 1 μL，加水至25 μL。普通PCR扩增条件：94 ℃预变性5min；94 ℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环； 72 ℃延伸8 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，进行16S rDNA测序分析，同时用全自动微生物鉴定系统进行菌种确认。

收集纯培养的菌落，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行二代全基因组测序。全基因组测序的主要过程：用MagPure 细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，用Illumina NovaSeq 6000测序系统构建文库。整个基因组DNA被随机片段化，平均大小为 200～400 bp。所选片段经过末端修复、3'腺苷酸化、接头连接和PCR扩增。用磁珠纯化后，用Qubit 4.0 荧光计进行文库定量，并通过2%琼脂糖凝胶电泳评估文库的长度。在Illumina NovaSeq 6000平台上测序，然后用Trimmomatic（v0.36）工具对初始读取的片段进行过滤，去除低质量碱基，获得质量合格的片段。使用SPAdes（v.15）工具完成基因组组装后，采用Gapfiller（v1.11）软件填补基因组空白。

以核心基因集的单拷贝基因集为多序列比对结果，以 Neighbour-joining 聚类方式，构建该分离菌株的系统进化树（核心基因树），以自展值百分比（bootstrap percentage，Bp）评估进化树分支可信度。

将15只BALB/c裸小鼠随机分为3组：对照组3只，高浓度组6只，低浓度组6只。适应性饲养3 d后，对照组用灭菌棉签蘸取生理盐水100 μL，沿裸小鼠颈背部脊柱滚动涂擦所在区域的皮肤；以1.8×10⁸ CFU/mL为高浓度组，1.8 × 10⁷ CFU/mL为低浓度组，用灭菌棉签分别蘸取不同浓度的纯培养的分离菌液均100 μL，对相同部位进行感染。每天早上9：00观察记录3组裸小鼠的临床症状，对首次发现皮屑的时间记录为皮屑第1天，感染28 d后，将所有裸小鼠行CO₂窒息并脱颈椎法安乐死。

采集裸小鼠的背部脊柱位置皮肤，经10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片（由上海千崖康药生物科技有限公司完成）后，通过常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察组织病理学变化。

针对牛棒状杆菌的核酸检测结果表明，这只患鳞状皮屑的裸小鼠的皮肤拭子样本用于实时荧光定量PCR未出现典型的扩增曲线（图 1），提示牛棒状杆菌核酸阴性。

将鳞状皮屑裸小鼠的皮肤拭子样本在高盐甘露醇琼脂平板上培养，生长出的菌落直径为（1.0±0.5）mm时，表面光滑，呈白色圆形凸起，周围有晕环（图2A）。而在血琼脂平板上菌落直径长至为（1.0±0.5）mm时，边缘整齐，表面光滑，且呈不溶血的灰白色圆形凸起，周围无晕环（图2B）。进一步的革兰染色结果显示阳性（图2C）。

从这只鳞状皮屑裸小鼠的皮肤拭子中分离培养的病原菌提取菌落基因组后，测得的16S rDNA序列经BLAST比对，发现与木糖葡萄球菌的16S rDNA序列同源性为 99.86%。用全自动微生物鉴定系统鉴定该菌株的置信度达95%（表1）。综合两种鉴定方法，结果提示该分离菌为木糖葡萄球菌。

全基因组测序后系统进化树分析结果表明，本分离株与韩国叶菜分离株 （GenBank GCA_002078255. 1）的亲缘关系最近（Bp为100）（图3）。然后将本次的分离株命名为slarc01，提交GenBank，登录ID号为JBHOFF000000000。

动物感染试验显示，生理盐水对照组裸小鼠未出现皮屑（图4A），而分离菌高浓度组和低浓度组的裸小鼠分别在17 d和20 d时头颈部和背部开始出现鳞状皮屑，随后逐渐扩散至其他部位，鳞状皮屑增多。症状较轻的小鼠仅颈部和背部出现皮屑（图4B）；症状严重的则在面部、头部、大腿外侧、背部及腹部均有皮屑（图4C和4D）。皮屑症状表现为一过性：高浓度组较为严重，持续7 d后皮屑消失；低浓度组症状较轻，持续3 d后皮肤恢复至原来的状态。高浓度组和低浓度组均各有2只裸小鼠出现皮屑，感染率均为 33.33%（2/6），其中高浓度组的鳞状皮屑症状较为严重，裸小鼠均抓咬背颈部等出现皮屑的位置。结果表明，木糖葡萄球菌感染后裸小鼠临床症状存在个体差异。

HE染色显示，与对照组（图5A）裸小鼠相比，低浓度组（图5B）和高浓度组（图5C）出现皮屑的裸小鼠其背部脊柱位置的皮肤表皮结构、真皮毛囊（黑色箭头）和皮脂腺（红色箭头）结构均完整，无明显充血、出血、炎症及坏死等病理性改变。

2023年，本实验室接检一只鳞状皮屑裸小鼠，根据其临床症状首先怀疑是牛棒状杆菌感染。然而，取该裸小鼠皮肤样本经核酸检测，结果显示牛棒状杆菌核酸阴性。接着采用细菌分离培养的方法，从其皮肤中分离出大量革兰阳性球菌，16S rDNA测序菌种鉴定和全自动微生物鉴定系统均显示该菌为木糖葡萄球菌。经回访，送检该患病裸小鼠的设施按国家标准规定的SPF级动物病原体项目每季度进行检测，结果均为阴性；且该设施温湿度符合国家标准要求，在同一设施饲养的其他裸小鼠未发现该病变，因此排除温湿度或其他药物因素等引起该病的可能。

木糖葡萄球菌通常被认为是一种非致病性共生细菌。但是，作为一种机会性致病病原菌，木糖葡萄球菌在免疫缺陷或基因敲除小鼠中可表现为不同的皮肤炎症^{［4，10，13-14］}。本研究结果提示，这只鳞状皮屑裸小鼠可能由木糖葡萄球菌感染导致。2012年的另一例临床诊断报告也阐述了类似的研究结果假设^［4］。病原菌鉴定结果反馈后，送检单位对出现该临床症状裸小鼠的供应商提供的所有动物进行了进一步排查，即对新购动物在接收当日进行采样送检，结果发现其中两家动物供应商的多个批次均检测出木糖葡萄球菌阳性，提示该细菌可能由供应商动物本身携带，且在国内动物供应商种群中并非偶发。因此，笔者建议：虽然木糖葡萄球菌未列入国家标准SPF级动物病原体排除列表，但仍应引起实验动物使用单位的注意^［15］。

为了深入了解木糖葡萄球菌对裸小鼠的致病性，本研究将分离的菌株进行了动物感染试验，设置低浓度组、高浓度组与对照组共3组。细菌接种后，每天笼边观察记录临床症状，28 d后结束试验。结果发现，高浓度组和低浓度组分别有2只裸小鼠皮肤上出现白色不规则鳞状皮屑，其中1只症状轻微的仅出现在头颈部和背部，另1只严重者的皮屑几乎完全覆盖背部、肩部、头部和胸腹部皮肤，和文献［4］描述的临床症状基本一致。不同的是，本研究中的裸小鼠皮屑临床症状为一过性，3～7 d即消失，没有明显脱落，而文献［4］中的皮屑伴有部分不规则地脱落，这可能是因为文献［4］中皮屑症状比较严重，已出现厚厚的成片的皮屑结块，因此容易脱落。本研究中，高低浓度两组各有4只裸小鼠未出现皮屑，表明裸小鼠感染木糖葡萄球菌存在个体差异。以往文献有报道，木糖葡萄球菌作为皮肤病原体的致病能力还存在物种特异性差异^［16-17］。

本研究中组织病理学HE染色结果表明，低浓度组和高浓度组出现皮屑的裸小鼠与对照组裸小鼠的表皮层结构以及真皮层毛囊和皮脂腺结构均完整，均无明显的充血、出血、炎症及坏死等病理性改变。这同以往文献的结论是一致的：在吞噬细胞超氧化物正常产生但有其他免疫缺陷的小鼠中，偶尔会出现浅表病变，仅限于眼睑、眼结膜和皮肤；而在吞噬细胞超氧化物缺失的小鼠中，木糖葡萄球菌感染会导致严重的组织病理学变化，包括淋巴结、肺、肌肉和骨骼等^［6，18］。文献［19-20］中，木糖葡萄球菌感染的裸小鼠组织病理学表现均有严重的表皮角质化、真皮层水肿和炎性细胞浸润等，导致该差异的原因可能跟菌株有关。菌株不同，毒力可能不同，临床症状和组织病理学结果也可能不同。另外，还有一篇文献报道木糖葡萄球菌感染的裸小鼠出现了皮角质化、真皮层水肿和炎性细胞浸润等临床症状，但这仅是一篇临床病例报道，并没有进行动物致病性实验^［4］。

由于皮肤黏膜中共生微生物、免疫和环境因素之间的复杂相互作用，木糖葡萄球菌引起裸小鼠发生鳞状皮屑疾病的机制尚未阐明。金黄色葡萄球菌肠毒素B或其衍生的α毒素可诱导白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）分泌，导致角质形成细胞异常增殖和炎性细胞募集^［21-23］。木糖葡糖球菌是否通过诱导IL-17A分泌，导致角质形成细胞异常增殖和炎性细胞募集有待进一步研究。本研究中动物感染试验的给药方式是涂擦皮肤，结果表明木糖葡萄球菌可通过接触方式进行传播，是否存在其他传播方式尚有待研究。在后续研究中，还可进一步探讨木糖葡萄球菌的致病机制，包括感染剂量、宿主个体差异等对病变程度的影响。本研究基于全基因组序列建立了该分离菌株的系统进化树，溯源分析后发现该菌株与韩国叶菜分离株（GenBank GCA_002078255.1）的亲缘关系最为接近，提示两者之间可能存在着未知途径的传播。

需要指出，本研究存在一定局限性。例如：（1）根据木糖葡萄球菌的动物感染试验中阴性对照未发生鳞状皮屑得出结论尚不够严谨，如果能排除引起鳞状皮屑的其他病原菌感染或合并真菌感染的可能性则更有说服力；（2）使用的实验动物品种、品系、性别、年龄和数量，以及使用的分离菌株有限。排除上述局限性后得出木糖葡萄球菌对裸小鼠有鳞状皮屑致病性的结论才更为准确和可靠。

综上所述，动物感染试验表明，本研究中分离的木糖葡萄球菌菌株对裸小鼠鳞状皮肤病是一种机会性感染病原体，临床表现为一过性的鳞状皮屑症状，组织病理学并未发生明显改变，并且裸小鼠对该菌株的敏感性存在个体差异。因此，不仅牛棒状杆菌，木糖葡萄球菌也可能使免疫缺陷裸小鼠出现鳞状皮肤病。为提高实验动物兽医师对该菌的认识和关注程度，避免木糖葡萄球菌感染导致免疫缺陷小鼠或基因敲除小鼠损失，迫切需要深入研究木糖葡萄球菌对免疫缺陷小鼠或基因敲除小鼠皮肤的致病性及其科学意义。

孔志豪, 魏晓锋, 于灵芝, 等. 鳞状皮屑裸小鼠木糖葡萄球菌的分离鉴定[J]. 实 验 动 物 与 比 较 医 学, 2025, 45(3): 368-375. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2024.166.

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