犬瘟热（canine distemper，CD）是一种危害幼犬，具有高度传染性的病毒性疾病；其发病率高且致死速度快，可通过直接接触或飞沫传播，是一种在世界范围内分布广泛的疾病。该病是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）感染导致。CDV属于副黏病毒科（paramyxoviridae）麻疹病毒属（morbillivirus），为RNA病毒。副黏病毒科还包含一系列高致病性的病毒，如麻疹病毒（measles virus，MeV）和牛瘟病毒（rinderpest virus，RPV）。与具有宿主特异性的MeV和RPV相比，CDV具有更显著的遗传多样性，其宿主范围很广，近些年更是突破了物种屏障^［1-3］。有研究显示，CDV可以感染至少6个目、20多个科的哺乳动物，包括家畜种群，以及自由或圈养的野生动物界的多个物种^［4-9］。CDV的主要宿主是犬和水貂，患病及带病毒的动物为主要传染源，主要通过动物的体液（鼻涕、唾液、尿液等）和粪便向外排毒。该病毒的组织侵蚀性非常广泛，有报道在患病动物的肝、肺、肾、淋巴结、脾、脑等器官组织中均可检测到病毒^［10-11］。

除犬科、浣熊科、熊科、鼬科、猫科外，非人灵长类动物对CDV也敏感^［12-15］。最早感染非人灵长类动物的病例是1989年由Yoshikawa等^［13］在自然感染犬瘟热病毒的日本猕猴中发现。近年来，CDV在非人灵长类动物中的感染时有报道，且非人灵长类动物感染后有2%~60%的致死率^［10］。2006年，在我国广西发生过恒河猴的感染^［11］。笔者所在单位苏州西山生物技术有限公司（下文简称本单位）在2019年底接收了一批来自华南一猴场疑似CDV感染的食蟹猴样本。本研究通过对患病动物临床表现症状追溯、分子生物学检测及所分离病毒的亲缘关系分析，确诊该猴场的食蟹猴感染了CDV；同时结合本单位多年来针对非人灵长类动物CDV的检测数据以及该猴场的隔离检测数据，探讨了CDV的诊断及控制措施，以期为开展CDV研究工作的同行提供技术参考。

来自华南地区某实验猴养殖场的21只患病食蟹猴的血清、皮肤红疹拭子样本，以及1只病死食蟹猴的EDTA抗凝全血、破溃皮肤、肺和肝脏组织，共46份样本，通过冷链运输，于2019年底送至本单位。随后本单位在2019年底及次年1月对送检样本进行鉴定诊断。

DNA/RNA共提取试剂盒（DP422）购自天根生化科技（北京）有限公司；随机引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；逆转录酶（2641A）购自日本TaKaRa公司；小鼠抗CDV单抗（MA1-82327）购自美国Thermo Fisher公司；免疫显色试剂（IHC-BD03-1）和DAB染色液（1904001）均购自广州安必平医药科技股份有限公司；病毒研究用MDCK细胞系购自北京北纳创联生物技术研究院；DMEM维持培养基（SH30243.01）购自美国HyClone公司。PCR仪（ABI 7500）购自美国Thermo Fisher公司；显微镜（BX43F）购自日本Olympus公司。

取21只患病猴血清、红疹拭子及1只病死猴的全血、皮肤、肺和肝脏组织，用DNA/RNA共提取试剂盒提取RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。提取的RNA用60 μL无RNA酶水洗脱，并用随机引物和逆转录酶逆转录为cDNA。逆转录反应体系共20 μL，含RNA模板9 μL、100 μmol/L随机引物1 μL、5×M-MLV Buffer 4 μL、200 U/μL逆转录酶0.5 μL、40 U/μL逆转录酶抑制剂0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL和RNase-Free ddH₂O 1 μL。逆转录反应程序：42 ℃ 10 min，95 ℃ 2 min。实时荧光定量PCR采用针对CDV核蛋白基因设计的引物^［16］：CDV-83F（5'-AGCTA-GTTTCATCTTAACTATCAAATT-3'）和CDV-83R（5'- TTAACTCTCCAGAAAACTCATGC-3'）。引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成。实时荧光定量PCR反应体系共20 μL，其中含5 μL样本cDNA模板（同时设置空白对照和阳性质粒对照）、10 μmol/L上下游引物各0.2 μL、2×SYBR Premix 10 μL和ROX（50×）0.4 μL。在PCR仪中95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸31 s（采集信号），进行40个循环，绘制熔解曲线。测得各样本循环阈值（cycle threshold，Ct），根据标准曲线公式计算样本中的病毒载量（拷贝数/μL）。

病死猴的肺组织制成冰冻切片，并于室温干燥约40 min，然后浸泡在冷丙酮中20 min，取出后室温干燥40 min，用PBS洗涤3次，每次1 min。实验组和空白对照组分别滴加体积稀释比例为1∶50的抗CDV单抗和PBS，两组同时进行以下操作：室温孵育60 min，然后用PBS洗涤3次，每次1 min；再滴加体积比3%的过氧化氢，室温孵育10 min，而后再次PBS洗涤3次，每次1 min；滴加辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗，室温孵育20 min，然后用PBS洗涤3次，每次1 min；滴加DAB显色剂染色3～10 min，流水冲洗10 min，去除切片上多余的水分，将切片依次浸入95%乙醇溶液、无水乙醇、环保透明剂中各2次，每次1 min，最后封固，镜检。

将病死猴皮肤置于适量无菌生理盐水中，用无菌剪刀剪碎后研磨。研磨后的样本过筛，收集滤液并用PBS稀释至2 mL。随后以4 000×g离心5 min，获得上清液，通过0.22 μm滤膜过滤。取500 μL组织滤液接种于培养的单层MDCK细胞系中作为实验组，未接种组织滤液的单层MDCK细胞系作为空白对照组，两组同时进行以下操作：37 ℃吸附1 h后，用PBS清洗细胞1次，再加入含2%胎牛血清的DMEM维持培养基，在37 ℃、5% CO₂条件下培养。此后每天观察细胞，直到出现细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。实验组在第8天时收集分离到的病毒，进行CDV特异性PCR验证，方法同1.3节。

取表现有细胞病变效应的MDCK细胞培养液，3 000×g离心5 min，取上清液20 μL加入5 mL聚乙二醇 6000混匀，4 ℃存放24 h，10 000×g离心20 min，取沉淀用DPBS重悬。重悬液送上海探普生物科技有限公司进行全基因组测序。用NovaSeq 6000（Illumina）测序仪测序，用SPAdes v3.13.0工具对病毒基因组进行组装，并将整个开放阅读框序列存放入美国国家生物技术信息中心管理的GenBank中。采用Clustal Omega工具对不同CDV分离株进行多序列比对和核苷酸百分比同源性计算，用Seaview 5.02^［17］和PhyML v3.1^［18］算法构建遗传发育树，并对其进行遗传进化分析。

经临床追溯，该批食蟹猴在2019年6月由越南购入猴场约半年后，部分动物开始出现面部皮屑（图1A）、红疹，随后出现流鼻涕（图1B），部分动物伴有腹泻。这些症状与同属于副黏病毒科麻疹病毒属的麻疹病毒感染食蟹猴的症状相似。部分病猴后期出现脓皮症（图1C），足部皮肤增厚并破溃（图1D），这一症状也是CDV感染食蟹猴的典型临床特征之一。解剖病死猴后，发现其肺部呈红色病变，大肠黏膜有明显出血，推测严重的肺炎可能是该病猴死亡的主要原因。另外，该实验猴养殖场同期共有26只食蟹猴出现上述症状，其中8只死亡；本次送检样本正是来自其中的21只患病猴和1只病死猴。

使用CDV特异性引物对21只患病猴和1只病死猴的送检样本进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，在21只患病猴血清、红疹拭子样本及1只病死猴的全血、皮肤、肺和肝脏组织中均成功扩增出CDV的核蛋白基因片段，即PCR结果全为阳性，其中1只病死猴全血、皮肤、肺和肝脏组织的Ct值分别为36.4、16.1、17.7和24.9，病毒载量分别为1.4 拷贝/μL、4.8×10⁵拷贝/μL、1.7×10⁵拷贝/μL和2.0×10³拷贝/μL，说明病死猴皮肤中的病毒载量最高。

使用针对CDV核蛋白的抗体对病死猴的肺组织进行免疫组织化学染色，结果显示在肺泡上皮细胞、支气管和细支气管处均出现棕褐色的特异性染色反应（图2），提示病死猴的肺组织中有明显的CDV感染。

病死猴的皮肤组织经研磨、过滤等处理后接种于培养的单层MDCK细胞，在接种后第4天出现疑似病毒感染后的细胞病变效应，第8天出现明显的细胞病变效应（图3A），表现为细胞重叠，部分细胞形态变为圆形，细胞质内颗粒增多，部分细胞坏死脱落。经CDV特异性PCR验证为阳性后，收集分离到的病毒，并命名为CDV/CYN/SUZ/2020株。未接种的MDCK细胞没有出现细胞病变效应（图3B）。

病毒株CDV/CYN/SUZ/2020分离自病死猴的皮肤组织，全基因组长度为15.67 kb。其完整核苷酸序列存入GenBank中，登录号为MT325867。该分离株的全长开放阅读框核苷酸序列是亚洲地区具有代表性的CDV株之一。将其核苷酸序列与亚洲地区常见的病毒株进行比对，结果（表1）显示：新分离的CDV/CYN/SUZ/2020株与在越南发现的CDV/dog/HCM/33/140816株^［19］的同源性最高，为98.86%；与中国发现的水貂ZC1310M株也有98.44%的一致性，但与水貂CDV 3株（疫苗株）的匹配度较低（92.14%），表明此次新发现的食蟹猴CDV株并非来源于疫苗株，而是野生型病毒株。另外，与其他实验猴中分离的CDV病毒株相比，CDV/CYN/SUZ/2020株与BJ-01株^［2］和CYN07-dV株^［10］有97.05%的相似性，与MKY-KM08株^［2］的相似度为96.93%。

在系统发育分析中，虽然新鉴定的CDV/CYN/SUZ/2020株属于亚洲1型遗传谱系（图4），但它与2006年广西犬瘟热恒河猴中分离的CDV株以及2008年北京犬瘟热恒河猴病例中发现的病毒株均不相同，与2008年日本食蟹猴感染病例中的病毒株也不相同。

有历史文献记载表明，CDV在1760年通过犬类传入欧洲某地，并引发了广泛流行，感染后的动物死亡率很高，最终传播到欧洲的其他地区^［20-21］。CDV和MeV均属于麻疹病毒属，具有相同的基因组结构，并有高度相似的核苷酸和氨基酸序列。有研究表明，CDV可能曾感染过人类，与一种人类神经性疾病——多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）存在某种关联^［3］。基于CDV和MeV在分子层面上的相关性，科学家们可以用CDV来研究麻疹的发病机制，并且开发疫苗和抗病毒疗法。尽管CDV具有宿主特异性，主要感染犬科动物，但它仍对包括非人灵长类在内的多种动物构成威胁。目前，国内外已有多起CDV感染非人灵长类动物的报道，且一旦感染，没有疫苗的保护，其发病率较高。接种MeV疫苗的动物通常也会对CDV产生免疫反应，所产生的抗体能够识别MeV和CDV之间保守的表位，从而为宿主提供一定程度的保护^［22-23］。因此推测，MeV免疫可能保护人类免受CDV感染，或至少使感染者未表现出临床症状。在感染CDV并接种MeV疫苗的非人灵长类动物模型中，动物产生的抗体可对CDV产生部分交叉反应，提供了一定的交叉保护^［24］。此外有文献报道，抗CDV血清治疗有助于促进CDV感染动物的康复^［11］。目前，已有CDV肽作为候选疫苗的研制报道，未来将有更为成熟的CDV疫苗产生^［25］。

本研究中，对患病猴和病死猴的临床标本进行实验室调查符合科赫法则^［10］，本实验室的检测结果和动物表现出的典型临床症状共同证明了CDV是导致该猴群疾病暴发的主要原因。本研究不仅进行了CDV的核酸检测，还检测了CDV抗体以及会导致皮疹的猴水痘病毒（simian varicella virus，SVV）、MeV的核酸及其抗体。结果显示，患病猴血清中的CDV和MeV抗体检测均为阳性，而SVV核酸、抗体以及MeV的核酸检测均为阴性，进一步说明了CDV与MeV抗体之间的交叉反应。

本单位为实验动物第三方检测机构。回溯本单位在2020年6月至2024年6月针对CDV的全部检测数据显示：3 414份实验猴血清样本中CDV抗体的总检出率为44.11%（1 506/3 414），其中食蟹猴的CDV抗体检出率为53.88%（903/1 676），恒河猴为37.14%（361/972），豚尾猴为31.54%（241/764）；11 333份全血、口腔/鼻拭子、粪便、肺组织等样本中CDV核酸的检出率为1.92%（218/11 333），其中食蟹猴为1.05%（76/7 268），恒河猴为3.49%（142/4 073）。可以看出，CDV抗体的阳性率远高于核酸阳性率。这可能是因为近年来随着各单位对CDV感染非人灵长类动物的认识和了解，加强了预防与监测工作，部分动物接种了犬瘟热疫苗，另外部分猴群接种了麻疹疫苗，而这都会使动物产生与CDV抗原的交叉反应。因此，与抗体检测结果相比，核酸检测的阳性率更能反映猴群的实际感染情况。在本案例中，共有26只食蟹猴发病，其中8只死亡；在得知检测结果后，该猴场迅速对患病动物及与其有接触的可疑动物进行了隔离（总计约200只），并对隔离动物接种了CDV疫苗。此后，该猴场出现类似CDV感染症状的实验猴大幅减少，未发现新病例，也无新增死亡动物。鉴于此，笔者建议将CDV纳入猴群的日常监测计划中。

据报道，从中国不同地区的狐狸、浣熊和水貂等动物中分离出来的CDV与来自国外不同地区的CDV一起构成了6个主要的遗传谱系，包括美国1型（大多数疫苗株）、美国2型、亚洲1型、亚洲2型等^［26-27］。亚洲1型CDV于1991年首次由日本报道^［28］，随后蔓延至多个亚洲国家，包括韩国、泰国和中国^［19］。近年，河南省的一个果子狸农场也暴发了CDV疫情，经全基因组测序发现，该病毒与1997年导致小熊猫死亡的CDV相似度高达98.7%~99.72%，而与美国1型的一致性很低；这株CDV不仅导致圈养动物的免疫衰竭，还可能增加人畜共患风险^［29］。

本研究对华南地区某养殖猴场发现CDV感染症状的21只患病猴的血清、皮肤红疹拭子以及1只病死猴的全血、皮肤、肺、肝脏样本进行CDV核蛋白基因特异性实时荧光定量PCR扩增，结果均为CDV阳性。随后，采用免疫组织化学染色技术检测肺组织中的CDV抗原，发现肺泡上皮细胞、支气管和细支气管处聚集了大量的CDV核蛋白抗原。最后，成功从CDV阳性病死猴的皮肤组织中分离出CDV株并进行了全基因组测序，构建了遗传发育树。遗传进化分析发现，新分离的CDV/CYN/SUZ/2020病毒株与其他已知的亚洲1型、亚洲2型和CDV疫苗株存在差异，但与2014年越南发现的CDV/dog/HCM/33/140816病毒株相似度最高；而越南发现的CDV株与中国河北发现的KC427278.1株亲缘关系最接近^［19］，这提示CDV的跨境传播可能发生在中国和越南之间。随后该猴场证实，此批食蟹猴确实是在CDV暴发感染的同年从越南引进。笔者认为，广泛研究来自中国不同地区及不同动物种属的CDV分离株，将有助于更好地了解中国CDV感染情况，特别是非人灵长类动物CDV的起源和演变，同时为CDV的诊断、疫苗研发和疾病防控提供重要支持。

王晨娟, 杨玲焰, 王立鹏, 等. 2019年某实验猴养殖场食蟹猴犬瘟热暴发 的 诊 断 [J]. 实 验 动 物 与 比 较 医 学 , 2025, 45(3): 360-367. DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2024.160.

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