猪是养殖范围最广的动物之一。猪的生理结构和解剖特征与人类存在高度相似性^［1］，使其能够成为当代生物医学研究领域（尤其是移植生物学领域）的大型模式动物^［2-4］。五指山猪以其体型小、性成熟早、遗传性状稳定等优势，成为培育实验用猪的理想猪种^［5-6］。目前，五指山猪已被广泛用于糖尿病^［7］、动脉粥样硬化^［8］、过敏^［9］和异种移植^［10］等研究。1996年，冯书堂等通过对比五指山猪与人类的器官生理指标，发现五指山猪器官不仅与人类的大小相近，而且解剖生理结构也与人类相似^［11-12］，提示五指山猪这一小型猪近交系是人类比较医学和器官移植用的理想素材。

猪的主要组织相容性复合体（major histo-compatibility complex，MHC）也称猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA），其相关基因座位于猪的7号染色体^［13］，主要由3个部分组成：MHC Ⅰ、MHC Ⅱ和MHC Ⅲ。MHC Ⅰ和MHC Ⅲ类分子的编码基因座位于7p1.1，MHC Ⅱ类分子的编码基因座位于7q1.1^［14］。MHC相关基因座长度为2.4～2.7 Mb，共包含约150个基因，其中至少有120个基因被预测具有生物学功能^［15］。MHC Ⅰ类、MHC Ⅱ类和MHC Ⅲ类分子的编码基因区域跨度分别约为1.1 Mb、0.5 Mb和0.7 Mb^［16］。Ⅰ类和Ⅱ类区域分别包含编码MHCⅠ类和Ⅱ类分子的基因序列，以及多个具有不同功能的非MHC基因。Ⅲ类区域位于Ⅰ类和Ⅱ类区域之间，不包含MHC基因，但包含关键的免疫相关基因。

MHC Ⅱ类分子的主要功能包括参与外源性抗原的递呈、胸腺内CD4⁺T细胞的分化和发育、免疫应答调节、移植排斥反应和作为CD4⁺T细胞的识别分子^［17］。MHC参与移植后免疫耐受的形成，是引起急性及慢性移植排斥反应的关键分子，同时也是影响移植物功能状态和存活期限的最重要变量。

本研究采用反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）扩增五指山猪MHC Ⅱ类分子的基因序列，并通过Sanger测序确定MHC Ⅱ类分子的基因序列。在此基础上，利用生物信息学方法，针对五指山猪全基因组数据，系统分析了MHCⅡ类分子的蛋白质理化性质、系统进化关系、保守结构域、基序（motif）特征以及染色体位置等。本研究旨在为五指山猪免疫系统的研究提供重要的数据支撑，为深入研究五指山猪免疫应答过程中MHC的生物学功能提供基础数据，并为疫苗开发、疾病防治、新型实验动物模型的建立以及人兽共患疾病研究提供新思路。

本研究选用的3头12月龄雄性非亲缘五指山猪来自海南省农业科学院畜牧兽医研究所［SCXK（琼）2014—0006］的国家级五指山猪保种场。所有五指山猪在饲养期间自由饮水，并饲喂自制猪饲料。实验开展前，经过全面的健康检查确认实验对象均无异常，然后采用电击后放血法安乐死动物，获取其脾脏组织。本研究方案通过海南省农业科学院畜牧兽医研究所实验动物伦理委员会审批（获批时间为2024年5月1日），所有实验操作均在该单位实验室内进行，符合实验动物福利伦理审查要求。

HiScriptⅣ第一链cDNA合成试剂盒（+gDNA wiper）（R412）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶试剂盒（R010A）购自宝生物工程（大连）有限公司；TransZol Up Plus RNA试剂盒（ER501）购自北京全式金生物技术股份有限公司；RePure-A（384）梯度PCR仪购自杭州柏恒科技有限公司；EPS-300电泳仪和Tanon-4600SF普通凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；MH15K-230904010微量高速离心机购自骋克仪器（上海）有限公司；NanoDrop ONE微量分光光度计购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

本研究中引物的设计是基于NCBI数据库中已公开的猪MHC Ⅱ类分子的基因序列信息，通过Primer- BLAST工具进行设计，确保引物特异性和扩增效率，可扩增完整的基因编码序列（coding sequence，CDS）。具体引物序列和扩增条件见表1，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

按照TransZol Up Plus RNA试剂盒说明书步骤提取五指山猪脾脏组织的总RNA，经分光光度计检测其浓度后，将RNA产物按照HiScriptⅣ 第一链cDNA合成试剂盒（+gDNA wiper）说明书步骤反转录成cDNA，cDNA产物置于-40 ℃冰箱保存。经分光光度计检测cDNA浓度后，将其与表1中的每对引物分别混合制备反应体系（含PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL、5×PrimeSTAR缓冲液10 μL、dNTP混合物4 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA模板1.0 μL、去RNA酶水32.5 μL），进行MHCⅡ类分子8个目的基因的PCR扩增。PCR程序：98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min，循环35次。最后，利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离与鉴定。

将琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后的扩增产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行Sanger测序。使用SnapGene软件查看测序结果，并将本次测序结果与NCBI数据库中已公开的猪MHC Ⅱ类分子的基因序列，以及海南省农业科学院畜牧兽医研究所已建五指山猪数据库中的MHCⅡ类分子基因进行比对。

利用MEGA7 Version软件，将已鉴定的MHC Ⅱ类分子基因的CDS与NCBI数据库上公布的智人（Homo sapiens）、食蟹猴（Macaca fascicularis）、牛（Bos taurus）、犬（Canis lupus familiaris）和猪（Sus scrofa11.1）的MHC Ⅱ类分子基因进行多序列比对，并采用最大似然法构建无根系统发育进化树。

利用SnapGene软件和PSIPRED工具（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）分析MHC Ⅱ类分子的氨基酸残基数量、相对分子质量、理论等电点和亲水性等理化性质。

利用在线工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）对MHC Ⅱ类分子的基序进行分析（参数为：最大基序数量设为10，最佳基序宽度设为6～50个氨基酸残基）。利用TBtools可视化分析MHC Ⅱ分子的基序。使用Batch CD-Search工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）预测保守结构域，利用TBtools可视化分析MHC Ⅱ类分子的保守结构域。

利用TBtools软件，从数据集中获取了五指山猪7号染色体的数据，基于该数据确定五指山猪MHC Ⅱ类分子基因在染色体上的位置并进行可视化分析。使用TBtools软件分析五指山猪7号染色体与杜洛克猪（Sus scrofa）7号染色以及智人（Homo sapiens）6号染色体的共线性关系。

提取的五指山猪脾脏组织总RNA经微量分光光度计检测RNA浓度为803 ng/μL，A260/A280为2.03。反转录获得的cDNA经分光光度计检测，cDNA的浓度为1 224.8 ng/μL，A260/A280为1.68。

以cDNA为模板，RT-PCR结果显示，编码MHC Ⅱ类分子的SLA-DRA、SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRB、SLA-DOB、SLA-DMB、SLA-DMA和SLA-DOA基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后 ，各目的条带的大小符合预期，且产物单一（图 1）。

将所扩增的SLA-DRA、SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRB、SLA-DOB、SLA-DMB、SLA-DMA和SLA-DOA基因产物的Sanger测序结果与NCBI数据库中猪MHC Ⅱ类分子基因的CDS进行比对，结果显示，所获得的片段序列与猪MHC 基因的CDS结果基本一致。将其完整序列上传至NCBI数据库，获得GenBank登录号分别为PQ182796、PQ182797、PQ182798、PQ182799、PQ182800、PQ182801、PQ182802和PQ164779。

利用MEGA7 Version软件在五指山猪染色体水平上共鉴定出8个MHC Ⅱ类分子基因，将其与智人、食蟹猴、牛、犬和杜洛克猪的MHC Ⅱ类分子基因的CDS序列进行比对，结果表明SLA-DRA（PQ182796）、SLA-DQA（PQ182797）、SLA-DQB（PQ182798）、SLA-DOB（PQ182800）、SLA-DMB（PQ182801）和SLA-DMA（PQ182802）在猪种内单独成为一个分支；SLA-DRB（PQ182799）和SLA-DRB/EU431221.1 CMS miniature分属于同一支，亲缘关系更近；SLA-DOA（PQ164779）和SLA-DOA/NM_001185143.1分属于同一支，亲缘关系更近（图 2）。结果提示，五指山猪的6个MHC Ⅱ类分子基因与杜洛克猪、梅山猪、大白猪和巴马猪等不同品种猪的MHC Ⅱ类分子基因不在同一个分支上。

由表 2可知，8个基因所编码的MHC Ⅱ类分子由250～272个氨基酸组成，相对分子质量范围为27 700～30 000。大部分MHC Ⅱ类分子的等电点在酸性范围内，仅有1个成员的等电点在碱性范围内。总的亲水性平均系数（grand average of hydropathicity，GRAVY）有2个在负值范围内，表明MHC Ⅱ类分子大部分为疏水性蛋白。

MEME工具分析8个MHC Ⅱ类分子的基序结果表明，归于同一亚区的基因含有相似的保守基序（图3A），都包含基序1和2。其中，MHC Ⅱ类分子Ⅱb亚区除了SLA-DMB基因（仅有基序1和2）外，其余3个基因SLA-DQB、SLA-DRB和SLA-DOB都含有基序1、2、3、4和6，SLA-DOB不含基序10；MHC Ⅱ类分子的Ⅱa亚区除了SLA-DMA基因（仅有基序1、2和9）外，其他的3个分子SLA-DRA、SLA-DQA和SLA-DOA都含有基序1、2、4、5、7和9，SLA-DRA也不含基序10。

使用Batch CD-Search工具对保守结构域进行预测，发现SLA-DQB、SLA-DRB、SLA-DOB和SLA-DMB这4个基因编码的MHC Ⅱ类分子都包含MHC Ⅱβ保守结构域；SLA-DRA、SLA-DQA、SLA-DMA和SLA-DOA这4个基因编码的MHCⅡ类分子都包含MHC Ⅱα保守结构域（图3B）。MHC Ⅱ类分子分属于Ⅱa和Ⅱb两个亚区，与先前文献报告的结果^［18］一致。

通过染色体定位分析发现，8个MHC Ⅱ类分子基因不均匀地分布在五指山猪的7号染色体上，具体是染色体长臂上（7q）（图4A）。利用TBtools分析了MHC Ⅱ类分子基因在不同猪种内以及与人之间的共线性关系，结果表明，五指山猪的8个基因与人的3个基因之间具有共线性关系，而与杜洛克猪（Sus scrofa）的5个基因之间呈现共线性关系（图4B）。

猪MHC于1970年被首次鉴定，是一组紧密连锁、高度多态的编码移植抗原^{［15，19］}。MHC Ⅱ类分子基因分为Ⅱa和Ⅱb两个亚区，分别编码α肽链和β肽链^［15］。目前，国内关于五指山猪MHC Ⅱ类分子基因的研究大多集中在多态性较高的外显子或单个基因的克隆分析，而对五指山猪MHC Ⅱ类分子基因CDS全长序列尚不清楚^{［12，20-21］}。

本研究对五指山猪MHC Ⅱ类分子基因进行了全基因组的鉴定和较为完整的生物信息学分析，从五指山猪7号染色体数据中筛选并鉴定出8个MHC Ⅱ类分子基因，其中4个属于Ⅱa亚区，4个属于Ⅱb亚区，Ⅱ类基因的分类与先前文献报告的研究结果^{［15，18］}一致。本研究通过RT-PCR进一步验证了这些基因序列的准确性，发现五指山猪MHC Ⅱ类分子基因数量与杜洛克猪（NCBI参考序列号为GCF_000003025.6）中MHC Ⅱ类分子基因数量一致，即Ⅱa亚区有4个基因，Ⅱb亚区有4个基因，并且MHC Ⅱ类分子大部分为疏水性蛋白。

系统进化分析结果显示，五指山猪的8个MHC Ⅱ类分子基因划分为2个亚区。其中，有2个基因分别与实验用小型猪（CMS miniature pig）和NM_001185143.1（NCBI数据库中未注明其物种）的MHC Ⅱ类分子基因在同一个分支上，表明他们具有很高的同源性；而另外6个MHC Ⅱ类分子基因并未与杜洛克猪、梅山猪、大白猪和巴马猪等其他品种猪的MHC Ⅱ类分子基因归于同一分支。在以人HLA-DRA、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DOB、HLA-DMB、HLA-DMA基因作为参照的情况下，五指山猪的SLA-DRA（PQ182796）、SLA-DQA（PQ182797）、SLA-DQB（PQ182798）、SLA-DOB（PQ182800）、SLA-DMB（PQ182801）和SLA-DMA（PQ182802）基因在遗传关系上分别位于人对应SLA基因的较远端分支，并各自独立形成一个分支。结果说明，五指山猪与其他MHC Ⅱ类基因具有相对较远的遗传距离和亲缘关系，是人MHC Ⅱ类分子基因的一个远系成员，进化比较缓慢。

五指山猪MHC Ⅱ类分子基因的多态性和功能多样性可能与其对多种疾病的易感性和抗性有关^［19］。已有研究表明，MHC基因与猪的寄生虫病、病毒性病、细菌性疾病，以及呼吸性疾病和皮肤疾病有一定的相关性^［21-22］。未来的研究可以进一步探讨这些基因在不同疾病中的具体作用机制。此外，大量研究表明，鲸、犬、牛、马和猴等动物中都含有MHC-DRB、MHC-DQB和MHC-DQA基因，这意味着这4种基因可能在进化历程中较早出现，而MHC-DRA、MHC-DOB、MHC-DOA、MHC-DMB和MHC-DMA等基因则可能是后续为了适应日益复杂的外部环境（特别是影响动物生长发育的各种因素）而逐渐进化产生的。

对MHC Ⅱ类分子基因在五指山猪和杜洛克猪间进行共线性分析表明，MHC Ⅱ类分子基因和同为猪科的杜洛克猪同源基因最多，而和人类之间仅有3个同源基因。这一结果表明，MHC Ⅱ类分子基因在种属间存在差异性，而在种属内具有高度保守性。研究显示，不同品种的猪有各自独特的生物多样性和遗传稳定性特征，使得不同品种猪的MHC基因表现出不同的多态性。蛋白的理化性质分析表明，五指山猪8个MHC Ⅱ类分子的相对分子质量为27 700～30 000，这一范围与猪MHC Ⅱ类分子的分子量范围基本吻合，从而证实了这些分子是猪MHC Ⅱ类分子的典型代表。对MHC Ⅱ类分子的保守基序进行分析时发现，该蛋白的保守基序具有多样性，提示五指山猪MHC Ⅱ类分子可能在功能上具有一定的多样性。

近年来，随着生物技术和基因组学的快速发展，越来越多的物种中针对MHC Ⅱ类分子的研究正在逐渐深入。MHC Ⅱ类分子在免疫应答过程中发挥着关键作用，尤其是在识别和递呈外源性抗原方面。然而，针对MHC Ⅱ类分子基因编码区全长序列的研究仍然相对较少。本研究首次在全基因组水平上对五指山猪的MHC Ⅱ类分子基因进行了系统鉴定，识别出了8个特定的MHC Ⅱ类分子基因。通过RT-PCR验证了其编码序列，结合生物信息学分析获得了这些基因的理化特性。

本研究结果填补了该领域空白，为五指山猪的免疫研究提供了基础数据，为疫苗开发和疾病防治提供了新思路。与以往研究^{［12，19，23］}相比，本研究从全基因组视角进行系统性分析，提供了更全面的基因组信息。然而，现有研究也存在一定局限性，如样本数量有限和功能验证不足。未来的研究可以进一步探讨这些基因在免疫应答中的具体功能，并且构建疾病模型，探索基因编辑技术在提高五指山猪健康状况和生产性能中的应用。通过对MHC Ⅱ类分子基因的深入研究，可以为了解人类疾病的免疫机制提供参考，促进人兽共患病的研究，推动疫苗和免疫治疗策略的开发；同时将有助于提高相关动物模型在医学研究中的应用价值，进一步推动兽医学与人类医学的交叉研究进展。

刘园园, 辛文水, 晁哲, 等 . 五指山猪 MHCⅡ类分子基因鉴定与分析[J]. 实 验 动 物 与 比 较 医 学 , 2025, 45(3): 340-348. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2024.135.

LIU Y Y, XIN W S, CHAO Z, et al. Identification and analysis of MHCⅡ genes in Wuzhishan pigs[J]. Lab Anim Comp Med, 2025, 45(3):340-348. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2024.135.