非动物实验替代知多少

doi:10.12300/j.issn.1674-5817.2025.117

摘要/Abstract

中图分类号:

Q95-33

孙强. 非动物实验替代知多少[J]. 实验动物与比较医学, 2025, 45(4): 508-514. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.117.

图/表 1

参考文献 14

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非动物实验替代方法（数量/个）	OECD测试指南编号	具体说明
皮肤腐蚀与刺激替代方法（4个）	第430号	利用大鼠皮肤圆片测定经皮电阻降低，判断测试化学品对角质层屏障的破坏程度，用来识别导致不可逆皮肤组织损伤（腐蚀性）的物质
	第431号	使用体外重建的人体表皮3D模型（由人体角质形成细胞构建的多层皮肤组织），通过细胞活力下降判断腐蚀性，进而用来区分腐蚀性和非腐蚀性化学物质，并可指示腐蚀强度等级
	第435号	使用人工合成膜（如Corrositex^®试剂）模拟皮肤，对试剂施加化学品后，观察膜的化学指示物变化，以检测腐蚀性，用来鉴别腐蚀性物质（不可逆皮肤损伤）
	第439号	利用重建的人体表皮模型评估化学品引起的细胞活力降低程度。该模型由人源表皮角质细胞构建，具有类似人体表皮的结构和生理功能，可以用来鉴定导致可逆性皮肤损伤（刺激）的物质
眼部腐蚀与刺激替代方法（9个）	第437号	牛角膜不透明和渗透性试验：利用屠宰副产品获得的新鲜牛眼角膜，暴露于测试化学品后，测量角膜的不透明度增加程度和荧光素透过量。通过角膜浊度和渗透性的变化来判断眼部腐蚀或严重刺激作用，可用来鉴定导致严重眼损伤（GHS 1类）或无须分类（Non-Classified）的物质
	第438号	离体鸡眼试验：利用屠宰所得鸡眼角膜，将试剂直接作用于鸡眼角膜并观察角膜肿胀、浑浊和荧光染色保留情况。用于识别引起严重眼损伤的化学品和不需归类为眼刺激或严重眼损伤的化学品，评估鸡眼的眼刺激性或腐蚀性
	第460号	荧光素泄漏测试方法：将试剂加入培养的Madin-Darby犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）的单层中短暂作用，然后测定荧光染料透过细胞层的程度。细胞层通透性的升高反映细胞损伤程度，用于识别眼腐蚀剂和强刺激物（评估眼腐蚀性或严重刺激性）
	第491号	短时暴露眼刺激体外法：使用兔角膜来源的Statens Seruminstitut rabbit cornea（SIRC）细胞单层，接触待测物5 min，之后通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定细胞活力。用于识别引起严重眼损伤的化学品和无须归类为眼刺激或严重眼损伤的化学品，使用兔角膜细胞评估眼腐蚀性或严重刺激性
	第492号	重建人角膜样上皮模型法：利用人源细胞重建的角膜类似上皮组织（如EpiOcular™等商业模型），将测试物质作用于组织表面，一定时间后通过MTT或水溶性四氮唑盐（water-soluble tetrazolium salts，WST）法测定细胞活力。用于识别无须分类和标注为眼刺激或严重眼损伤的化学品
	第492B号	重建人角膜样上皮法（皮肤模型SkinEthic版）：与TG 492类似，采用重建人角膜上皮组织，但通过调整暴露时间（液体为2个时长，固体为3个时长）来提高对不同刺激强度的检测。通过多时间点的细胞活力测定，可区分无刺激、刺激和腐蚀各级别。可全面识别导致严重眼损伤（Cat.1）、引起眼刺激（Cat.2）以及无须分类（No Cat）的物质，实现对眼刺激危险性的完整分类
	第494号	VitreGel眼刺激性测试方法：利用胶原凝胶膜培养的人角膜上皮细胞（human cell emulation，hCE）模型，测试物接触细胞后，通过测定跨上皮电阻随时间的变化来评估角膜屏障受损程度。以屏障功能下降与否来反映物质的刺激性。用于识别无须分类为眼刺激或严重眼损伤的化学品
	第496号	体外大分子基质法眼损伤试验：使用由脂质、蛋白质、多糖等组成的人工生物高分子基质模型（Ocular Iritection^®等），模拟角膜组织。将待测化学品加入基质中，在模拟泪液环境和光照条件下，通过测量基质浑浊度的增加程度来预测眼刺激性反应程度。用于识别引起严重眼损伤的化学品及无须分类为眼刺激或严重眼损伤的化学品，推荐作为测试策略的初始步骤（详见OECD指南文件第263号），用于识别引起严重眼损伤的化学品
	第467号	严重眼损伤和眼刺激的限定性方法（综合判定方法）：通过集成多个信息源，如体外实验数据、理化性质、计算机预测模型和规则判读程序，判定化学品是否属于联合国全球统一分类和标签制度中眼部毒性分类，即严重眼损伤（类别1）、眼刺激（类别2）及无须分类（2022年发布，是继2021年TG 497后又一个可以完全实现动物替代的联合方法）
皮肤吸收替代方法（1个）	第428号	皮肤吸收体外方法：适用于经皮吸收或渗透评估，使用人体或动物皮肤离体扩散池测定化学品透过皮肤的量。此方法用于风险评估中估计人体经皮暴露量
皮肤致敏性替代方法（4个）	第442C号	蛋白质共价结合的体外化学方法：针对皮肤致敏不良效应路径(adverse outcome pathway，AOP)的蛋白质结合关键事件，测定化学品与合成多肽的反应程度，预测致敏可能性
	第442D号	抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）-核因子-红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrt2）萤光素酶报告基因法：针对AOP中角质形成细胞激活关键事件。包括KeratinoSens™和LuSens两种ARE-Nrf2通路报告基因试验，以及新增的EpiSensA重建皮肤试验。通过检测角质细胞应激反应的基因表达可鉴别致敏物
	第442E号	树突细胞激活试验：针对AOP中树突细胞激活关键事件。包含人源细胞系树突细胞激活试验，如人细胞系活化试验（human cell line activation test，h-CLAT）、U937皮肤致敏试验（U937 skin sensitization test，U-SENS）以及2022年新增的GARD™skin基因表达试验。这些体外方法能预测免疫细胞对致敏物的反应
	第497号	皮肤致敏的规定性综合方法：提供固定信息源组合和算法的定义性方法，综合直接肽反应性测定（direct peptide reactivity assay，DPRA）、KeratinoSens、h-CLAT等数据进行致敏性预测。包含“三步中的两步”(2/3)等判定策略，可根据多个非动物试验结果直接判断化学品致敏性，无须专家判断。这是OECD首个综合决策指南（2021年发布），已被国际监管机构认可，是可用于替代动物致敏试验的不确定性决策
光毒性替代方法（3个）	第432号	体外3T3中性红摄取光毒性试验：适用于光毒性（皮肤光敏性）初筛，通过测定小鼠3T3细胞在有/无紫外光（ultraviolet，UV）光照下存活率降低程度以评估化合物光毒性
	第495号	活性氧光反应试验：适用于光反应性的检测，通过在化学体系中测定试剂在紫外-可见光照射下所产生的活性氧（如单线态氧和超氧阴离子）量，以预测其潜在的光毒性风险
	第498号	重建人表皮模型法：适用于光毒性检测，利用3D人表皮模型，在有/无UV照射条件下评估化学品对皮肤组织活力的影响。该方法模拟皮肤实际情况，可更准确预测体内光毒性反应
遗传毒性（基因毒性）替代方法（5个）	第471号	细菌回复突变试验：适用于基因突变检测，以多株沙门氏菌和大肠杆菌测定化学品诱变作用。Ames试验作为国际标准，无须动物且灵敏可靠，长期用于法规要求（如欧盟的REACH）以替代啮齿动物突变试验
	第473号	体外哺乳动物染色体畸变试验：适用于染色体畸变检测，使用经培养的人或啮齿动物细胞来观察化学品诱发的染色体断裂和重组情况。作为标准的非动物实验方法，该试验已被OECD纳入法规数据要求（如工业化学品、药物），可完全替代相应的动物骨髓畸变试验
	第476号	体外哺乳动物细胞基因突变试验（Hprt/xprt基因）：适用于基因突变检测，在培养的哺乳动物细胞（如CHO或鼠淋巴细胞）中测定Hprt或xprt基因座突变。此试验与Ames互补，用于鉴定不同作用机制的致突变物
	第487号	体外哺乳动物细胞微核试验：适用于染色体损伤检测，通过观察培养细胞有无微核形成评估化学品引起的染色体断裂或整倍体改变。该方法相当于体内骨髓微核试验的替代，被ICH和REACH等法规广泛接受，可以完全取代动物微核试验用于初步筛查
	第490号	体外哺乳动物细胞TK基因突变试验：适用于基因突变检测，利用鼠淋巴瘤细胞的胸苷激酶（thymidine kinase）基因缺失突变作为终点。相比TG 476，可检测更广泛类型的基因改变（包括大片段缺失）。该方法于2015年纳入OECD指南，作为提高灵敏度的附加替代试验，被欧盟和美国采用
内分泌干扰相关替代方法（5个）	第455号	稳定转染转录激活法检测雌激素受体激动剂/拮抗剂：用于内分泌雌激素活性筛查。TG 455作为性能导向的指南，包括多种稳定转染的人源雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）报告基因细胞系（如VM7Luc4E2等），可提供定量剂量反应数据，鉴定化学品的雌激素受体（estrogen receptor，ER）激动或拮抗活性。此试验替代啮齿动物子宫增重试验等体内筛查，已被欧美等国家的法规认可，用于识别潜在内分泌干扰物
	第457号	BG1Luc雌激素受体转录激活试验：适用于雌激素受体激动剂/拮抗剂检测，以人卵巢癌BG1细胞报告基因系统评估ER介导的转录激活。TG 457是特定方法实例，于2012年采用。其功能被TG 455涵盖，但TG 457作为支持材料保留。已被美国EPA等接受，用于筛选环境化学品的雌激素活性
	第458号	人源雄激素受体（androgen receptor，AR）转录激活试验：用于雄激素受体激动剂/拮抗剂检测，利用人源AR转录激活报告细胞筛查化学品的AR活性或抗性。TG 458收录多种等效方法（如AR-EcoScreen™、AR-CALUX^®），2023年更新包括所有验证方法。该试验可替代啮齿动物前列腺增生试验（Hershberger试验）的初筛作用，OECD的成员国已互认其数据
	第456号	H295R类固醇生成试验：适用于甾体激素合成干扰检测，采用人肾上腺皮质腺瘤细胞系H295R，测定化学品对雌二醇和睾酮合成分泌的影响。可筛查化学物质对内分泌系统的干扰（如芳香化酶抑制），替代部分动物内分泌试验。TG 456于2011年发布，已被OECD及美国EPA等用于识别潜在内分泌干扰物
	第493号	人重组雌激素受体结合试验性能导向指南：用于雌激素受体配体结合检测，包含多种经验证的人源ERα配体结合试验方法（如放射配体结合或荧光偏振法）。TG 493确保任何符合性能标准的hrER结合方法均可用于筛查化学品ER结合亲和力。2015年被OECD采用，2024年更新。尽管OECD TG 493在检测化学品与雌激素受体的结合亲和力方面具有高效性，但其仅提供结合亲和力的信息，不能评估化学品是否具有激动剂或拮抗剂的功能活性。因此，建议将其与其他测试方法（如OECD TG 455）结合使用，以全面评估化学品的雌激素活性。此外，OECD TG 493的适用性可能受到测试化学品溶解性、稳定性和与放射性配体竞争能力的影响，某些化学品可能不适用于该测试方法
免疫毒性替代方法（1个）	第444A号	体外免疫毒性IL-2-Luc试验：适用于免疫毒性初筛，利用人类T细胞白血病Jurkat衍生细胞系稳定表达萤光素酶报告基因，检测化学品诱导的IL-2和IFN-γ基因调控。该方法定量测定免疫相关基因的活化抑制，以评估化学品对T细胞功能的潜在毒性（2023年正式通过）

非动物实验替代方法（数量/个）	OECD测试指南编号	具体说明
皮肤腐蚀与刺激替代方法（4个）	第430号	利用大鼠皮肤圆片测定经皮电阻降低，判断测试化学品对角质层屏障的破坏程度，用来识别导致不可逆皮肤组织损伤（腐蚀性）的物质
	第431号	使用体外重建的人体表皮3D模型（由人体角质形成细胞构建的多层皮肤组织），通过细胞活力下降判断腐蚀性，进而用来区分腐蚀性和非腐蚀性化学物质，并可指示腐蚀强度等级
	第435号	使用人工合成膜（如Corrositex^®试剂）模拟皮肤，对试剂施加化学品后，观察膜的化学指示物变化，以检测腐蚀性，用来鉴别腐蚀性物质（不可逆皮肤损伤）
	第439号	利用重建的人体表皮模型评估化学品引起的细胞活力降低程度。该模型由人源表皮角质细胞构建，具有类似人体表皮的结构和生理功能，可以用来鉴定导致可逆性皮肤损伤（刺激）的物质
眼部腐蚀与刺激替代方法（9个）	第437号	牛角膜不透明和渗透性试验：利用屠宰副产品获得的新鲜牛眼角膜，暴露于测试化学品后，测量角膜的不透明度增加程度和荧光素透过量。通过角膜浊度和渗透性的变化来判断眼部腐蚀或严重刺激作用，可用来鉴定导致严重眼损伤（GHS 1类）或无须分类（Non-Classified）的物质
	第438号	离体鸡眼试验：利用屠宰所得鸡眼角膜，将试剂直接作用于鸡眼角膜并观察角膜肿胀、浑浊和荧光染色保留情况。用于识别引起严重眼损伤的化学品和不需归类为眼刺激或严重眼损伤的化学品，评估鸡眼的眼刺激性或腐蚀性
	第460号	荧光素泄漏测试方法：将试剂加入培养的Madin-Darby犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）的单层中短暂作用，然后测定荧光染料透过细胞层的程度。细胞层通透性的升高反映细胞损伤程度，用于识别眼腐蚀剂和强刺激物（评估眼腐蚀性或严重刺激性）
	第491号	短时暴露眼刺激体外法：使用兔角膜来源的Statens Seruminstitut rabbit cornea（SIRC）细胞单层，接触待测物5 min，之后通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定细胞活力。用于识别引起严重眼损伤的化学品和无须归类为眼刺激或严重眼损伤的化学品，使用兔角膜细胞评估眼腐蚀性或严重刺激性
	第492号	重建人角膜样上皮模型法：利用人源细胞重建的角膜类似上皮组织（如EpiOcular™等商业模型），将测试物质作用于组织表面，一定时间后通过MTT或水溶性四氮唑盐（water-soluble tetrazolium salts，WST）法测定细胞活力。用于识别无须分类和标注为眼刺激或严重眼损伤的化学品
	第492B号	重建人角膜样上皮法（皮肤模型SkinEthic版）：与TG 492类似，采用重建人角膜上皮组织，但通过调整暴露时间（液体为2个时长，固体为3个时长）来提高对不同刺激强度的检测。通过多时间点的细胞活力测定，可区分无刺激、刺激和腐蚀各级别。可全面识别导致严重眼损伤（Cat.1）、引起眼刺激（Cat.2）以及无须分类（No Cat）的物质，实现对眼刺激危险性的完整分类
	第494号	VitreGel眼刺激性测试方法：利用胶原凝胶膜培养的人角膜上皮细胞（human cell emulation，hCE）模型，测试物接触细胞后，通过测定跨上皮电阻随时间的变化来评估角膜屏障受损程度。以屏障功能下降与否来反映物质的刺激性。用于识别无须分类为眼刺激或严重眼损伤的化学品
	第496号	体外大分子基质法眼损伤试验：使用由脂质、蛋白质、多糖等组成的人工生物高分子基质模型（Ocular Iritection^®等），模拟角膜组织。将待测化学品加入基质中，在模拟泪液环境和光照条件下，通过测量基质浑浊度的增加程度来预测眼刺激性反应程度。用于识别引起严重眼损伤的化学品及无须分类为眼刺激或严重眼损伤的化学品，推荐作为测试策略的初始步骤（详见OECD指南文件第263号），用于识别引起严重眼损伤的化学品
	第467号	严重眼损伤和眼刺激的限定性方法（综合判定方法）：通过集成多个信息源，如体外实验数据、理化性质、计算机预测模型和规则判读程序，判定化学品是否属于联合国全球统一分类和标签制度中眼部毒性分类，即严重眼损伤（类别1）、眼刺激（类别2）及无须分类（2022年发布，是继2021年TG 497后又一个可以完全实现动物替代的联合方法）
皮肤吸收替代方法（1个）	第428号	皮肤吸收体外方法：适用于经皮吸收或渗透评估，使用人体或动物皮肤离体扩散池测定化学品透过皮肤的量。此方法用于风险评估中估计人体经皮暴露量
皮肤致敏性替代方法（4个）	第442C号	蛋白质共价结合的体外化学方法：针对皮肤致敏不良效应路径(adverse outcome pathway，AOP)的蛋白质结合关键事件，测定化学品与合成多肽的反应程度，预测致敏可能性
	第442D号	抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）-核因子-红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrt2）萤光素酶报告基因法：针对AOP中角质形成细胞激活关键事件。包括KeratinoSens™和LuSens两种ARE-Nrf2通路报告基因试验，以及新增的EpiSensA重建皮肤试验。通过检测角质细胞应激反应的基因表达可鉴别致敏物
	第442E号	树突细胞激活试验：针对AOP中树突细胞激活关键事件。包含人源细胞系树突细胞激活试验，如人细胞系活化试验（human cell line activation test，h-CLAT）、U937皮肤致敏试验（U937 skin sensitization test，U-SENS）以及2022年新增的GARD™skin基因表达试验。这些体外方法能预测免疫细胞对致敏物的反应
	第497号	皮肤致敏的规定性综合方法：提供固定信息源组合和算法的定义性方法，综合直接肽反应性测定（direct peptide reactivity assay，DPRA）、KeratinoSens、h-CLAT等数据进行致敏性预测。包含“三步中的两步”(2/3)等判定策略，可根据多个非动物试验结果直接判断化学品致敏性，无须专家判断。这是OECD首个综合决策指南（2021年发布），已被国际监管机构认可，是可用于替代动物致敏试验的不确定性决策
光毒性替代方法（3个）	第432号	体外3T3中性红摄取光毒性试验：适用于光毒性（皮肤光敏性）初筛，通过测定小鼠3T3细胞在有/无紫外光（ultraviolet，UV）光照下存活率降低程度以评估化合物光毒性
	第495号	活性氧光反应试验：适用于光反应性的检测，通过在化学体系中测定试剂在紫外-可见光照射下所产生的活性氧（如单线态氧和超氧阴离子）量，以预测其潜在的光毒性风险
	第498号	重建人表皮模型法：适用于光毒性检测，利用3D人表皮模型，在有/无UV照射条件下评估化学品对皮肤组织活力的影响。该方法模拟皮肤实际情况，可更准确预测体内光毒性反应
遗传毒性（基因毒性）替代方法（5个）	第471号	细菌回复突变试验：适用于基因突变检测，以多株沙门氏菌和大肠杆菌测定化学品诱变作用。Ames试验作为国际标准，无须动物且灵敏可靠，长期用于法规要求（如欧盟的REACH）以替代啮齿动物突变试验
	第473号	体外哺乳动物染色体畸变试验：适用于染色体畸变检测，使用经培养的人或啮齿动物细胞来观察化学品诱发的染色体断裂和重组情况。作为标准的非动物实验方法，该试验已被OECD纳入法规数据要求（如工业化学品、药物），可完全替代相应的动物骨髓畸变试验
	第476号	体外哺乳动物细胞基因突变试验（Hprt/xprt基因）：适用于基因突变检测，在培养的哺乳动物细胞（如CHO或鼠淋巴细胞）中测定Hprt或xprt基因座突变。此试验与Ames互补，用于鉴定不同作用机制的致突变物
	第487号	体外哺乳动物细胞微核试验：适用于染色体损伤检测，通过观察培养细胞有无微核形成评估化学品引起的染色体断裂或整倍体改变。该方法相当于体内骨髓微核试验的替代，被ICH和REACH等法规广泛接受，可以完全取代动物微核试验用于初步筛查
	第490号	体外哺乳动物细胞TK基因突变试验：适用于基因突变检测，利用鼠淋巴瘤细胞的胸苷激酶（thymidine kinase）基因缺失突变作为终点。相比TG 476，可检测更广泛类型的基因改变（包括大片段缺失）。该方法于2015年纳入OECD指南，作为提高灵敏度的附加替代试验，被欧盟和美国采用
内分泌干扰相关替代方法（5个）	第455号	稳定转染转录激活法检测雌激素受体激动剂/拮抗剂：用于内分泌雌激素活性筛查。TG 455作为性能导向的指南，包括多种稳定转染的人源雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）报告基因细胞系（如VM7Luc4E2等），可提供定量剂量反应数据，鉴定化学品的雌激素受体（estrogen receptor，ER）激动或拮抗活性。此试验替代啮齿动物子宫增重试验等体内筛查，已被欧美等国家的法规认可，用于识别潜在内分泌干扰物
	第457号	BG1Luc雌激素受体转录激活试验：适用于雌激素受体激动剂/拮抗剂检测，以人卵巢癌BG1细胞报告基因系统评估ER介导的转录激活。TG 457是特定方法实例，于2012年采用。其功能被TG 455涵盖，但TG 457作为支持材料保留。已被美国EPA等接受，用于筛选环境化学品的雌激素活性
	第458号	人源雄激素受体（androgen receptor，AR）转录激活试验：用于雄激素受体激动剂/拮抗剂检测，利用人源AR转录激活报告细胞筛查化学品的AR活性或抗性。TG 458收录多种等效方法（如AR-EcoScreen™、AR-CALUX^®），2023年更新包括所有验证方法。该试验可替代啮齿动物前列腺增生试验（Hershberger试验）的初筛作用，OECD的成员国已互认其数据
	第456号	H295R类固醇生成试验：适用于甾体激素合成干扰检测，采用人肾上腺皮质腺瘤细胞系H295R，测定化学品对雌二醇和睾酮合成分泌的影响。可筛查化学物质对内分泌系统的干扰（如芳香化酶抑制），替代部分动物内分泌试验。TG 456于2011年发布，已被OECD及美国EPA等用于识别潜在内分泌干扰物
	第493号	人重组雌激素受体结合试验性能导向指南：用于雌激素受体配体结合检测，包含多种经验证的人源ERα配体结合试验方法（如放射配体结合或荧光偏振法）。TG 493确保任何符合性能标准的hrER结合方法均可用于筛查化学品ER结合亲和力。2015年被OECD采用，2024年更新。尽管OECD TG 493在检测化学品与雌激素受体的结合亲和力方面具有高效性，但其仅提供结合亲和力的信息，不能评估化学品是否具有激动剂或拮抗剂的功能活性。因此，建议将其与其他测试方法（如OECD TG 455）结合使用，以全面评估化学品的雌激素活性。此外，OECD TG 493的适用性可能受到测试化学品溶解性、稳定性和与放射性配体竞争能力的影响，某些化学品可能不适用于该测试方法
免疫毒性替代方法（1个）	第444A号	体外免疫毒性IL-2-Luc试验：适用于免疫毒性初筛，利用人类T细胞白血病Jurkat衍生细胞系稳定表达萤光素酶报告基因，检测化学品诱导的IL-2和IFN-γ基因调控。该方法定量测定免疫相关基因的活化抑制，以评估化学品对T细胞功能的潜在毒性（2023年正式通过）

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