心脏自主神经系统（autonomic nervous system，ANS）包括交感神经和迷走神经，在心肌细胞电生理活动和机械功能调节中起关键作用^［1］。交感神经兴奋后通过β肾上腺素能受体促进Ca²⁺通道开放，加强心肌自律细胞4期自动除极，导致心房肌细胞自律性增强、兴奋性增加、传导速度加快，缩短心房有效不应期^［2］。迷走神经兴奋通过释放乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），激活K⁺通道，促进K⁺外流，缩短动作电位时程和有效不应期，增加心房有效不应期离散度，提高房颤易感性^［3］。本研究将联合使用交感神经调节剂氯化钙（calcium chloride，CaCl₂）和迷走神经调节剂ACh构建ANS紊乱所诱发的大鼠心房颤动（简称房颤）动物模型，并对模型大鼠心房电生理特性和组织细胞学特征进行评估，以期为房颤发病机制研究及新诊疗方法的研发提供实验条件和数据支持。

选用10只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重约200～250 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司［SCXK（京）2024-0003］提供，实验动物质量合格证号为No.110322251100812761。动物饲养于中国医学科学院阜外医院动物实验中心［SYXK（京）2022-0020］的标准化动物饲养设施，饲养环境保持12 h光照/12 h黑暗的明暗循环，室温控制在22～24 ℃，相对湿度维持在60%～70%。大鼠分笼饲养，每笼不超过3只，均自由采食和饮水。本研究方案经中国医学科学院阜外医院实验动物管理和使用委员会批准［0108-7-110-ZX（X）-017］，所有实验操作均严格遵循动物实验伦理规范和相关法律法规。

CaCl₂（ST365）、含DAPI的抗荧光淬灭封片液（P0131）、RIPA裂解液（P0013B）、通用型蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（P1045）购自上海碧云天生物科技有限公司；稳定的ACh即氯乙酰胆碱（A6625）、改良Krebs-Henseleit缓冲液（K3753）、氯化钙二水合物（C7902）、碳酸氢钠（S8761）和麦胚凝集素（wheat-germ agglutinin，WGA）（L4895）购自美国Sigma-Aldrich公司；改良Masson三色染色试剂盒（G1346）购自北京索莱宝科技有限公司；二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）（HY-D0079）购自美国MedChemExpress公司；异氟烷（20250403）购自瑞普生物股份有限公司；GAPDH兔单克隆抗体（A19056）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）多克隆抗体（10375-2-AP）、α-辅肌动蛋白（α-Actinin）单克隆抗体（66895-1-Ig）、CoraLite594标记的山羊抗小鼠二抗（SA00013-3）、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（SA00001-2）购自美国Proteintech公司；白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）抗体（ab283818）购自英国Abcam公司；10×电泳缓冲液（B1005）、组织冰冻切片包埋剂（C1400）购自北京普利莱基因技术有限公司；Omni-Flash™免冰浴快速转膜缓冲液（PS201S）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法原位细胞凋亡检测试剂盒（11684795910）购自瑞士Roche公司；PVDF转印膜（IPVH00010）购自美国Merck Millipore公司；增强型化学发光底物（34590）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；柠檬酸盐修复液（ZLI-9065）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；肝素钠注射液（152511113A）购自常州千红生化制药股份有限公司。

动物心电图采集与解析系统（SP2006）购自北京软隆生物技术有限公司；超高分辨率小动物超声成像系统（Vevo 2100）及其配套MX250型号探头购自加拿大Fujifilm VisualSonics公司；矩阵式多通道电生理标测系统（EMS64-USB-1003）购自英国MappingLab公司；烤片机（HI12201）和常规荧光倒置显微镜（DMIL LED）购自德国Leica公司；全自动数字切片扫描分析系统（Pannoramic 250FlashⅡ）购自匈牙利3D HISTECH公司；三维冷冻研磨仪（JXCL-3K）购自上海净信实业发展有限公司。

10只SD大鼠适应性观察1周后，进行个体编号，随机分为实验组和对照组，每组5只。实验组每日通过尾静脉注射CaCl₂（10 mg/mL）和ACh（66 μg/mL）混合溶液（溶剂为生理盐水），剂量为0.1 mL/100 g体重，连续给药28 d。对照组每天接受等体积的生理盐水尾静脉注射，持续28 d。

每天给药前1 min到给药后5 min，每只大鼠都进行心电图检测。通过3%异氟烷吸入法麻醉实验动物，并将其以仰卧位固定于保温垫上，四肢自然伸展，避免过度牵拉。在2%异氟烷维持麻醉状态下备皮，用4个注射器针头穿过动物四肢皮肤，将钳式导联线按照放大器上的标识分别连接在4个针头上。启动动物心电图采集与解析系统，待动物心电稳定后开始采集心电图。使用前校正仪器，确保信号稳定无噪声。

给药4周后，通过3%异氟烷吸入法麻醉每只动物，利用超高分辨率小动物超声成像系统及其配套MX250型探头进行长轴切面和胸骨旁短轴切面超声图像的采集。采用B超模式获取图像，用于测量左房前后径；采用M超模式记录左心室运动曲线，用于测量左室射血分数、左室短轴缩短分数、左室舒张末内径和左室收缩末内径。然后每组随机选取3只大鼠用于后续离体心脏电生理检测，其余大鼠直接称量体重后以放血法安乐死，并立即摘取心脏，冲洗后称取心脏质量。

超声结束后，每组随机选取3只大鼠，利用矩阵式多通道电生理标测系统检测。根据大鼠体重，腹腔注射肝素钠5 U/g，15 min后经3%异氟烷深度麻醉后称量体重，随后放血法安乐死。快速打开胸腔，摘取心脏并找到主动脉，迅速将主动脉连接并固定于灌流针上，随后与灌流管路相连；待心脏稳定跳动，无残血泵出后，开始循环灌流反应罐中的改良Krebs-Henseleit缓冲液（每升改良Krebs-Henseleit缓冲液中添加0.373 g氯化钙二水合物和28 mL碳酸氢钠溶液）。将心电图电极置于心脏两侧，监测心脏状态。将笔式电极紧贴于心脏左右心房，刺激电极置于左心房给予起搏刺激。先给予8 Hz的起搏频率，通过EMapScope 5多通道数据采集和分析软件获取基线电生理参数（含电传导速度和传导离散度）以及等时图（含传导时间和离散时间）。然后以50 Hz起搏2 s，共进行5次起搏，间隔时间30 s，观察离体心脏的心电图变化。以导致房颤发作的突发性起搏的百分比，计算房颤诱发率。房颤诱发率（%）=［50 Hz诱发房颤的刺激次数÷总刺激次数（5次）×100%］。实验结束后称取心脏质量。

冻存每组3只大鼠的心房组织，每只取20 mg，用研磨仪进行匀浆研磨，组织裂解后提取蛋白，随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V电压下电泳25 min后转为120 V电压1 h。电泳结束后以400 mA恒流转膜1 h，随后用封闭液（5%脱脂奶粉）在室温下封闭1 h。TBST洗涤后加入GAPDH、MMP-9或IL-1β一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，加入二抗并室温孵育1 h。再次用TBST洗涤后，加入增强型化学发光液进行曝光显影。使用ImageJ软件分析各条带灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白的相对表达水平。对照组作均一化处理。

取每组2只大鼠的心脏组织，平行心耳纵切，将心脏一分为二，一半心脏组织于4%多聚甲醛溶液固定48 h后，流水冲洗30 min，经全自动脱水机脱水，石蜡包埋，5 μm连续切片，42 ℃展片，用防脱载玻片捞片，晾干备用。石蜡切片放置烤片机上68 ℃烘烤45 min，随后进行脱蜡处理。苏木精染色后，用盐酸乙醇溶液分化，再用伊红染色，最后脱水透明，封片。通过全自动数字切片扫描分析系统观察心肌细胞的形态、排列情况以及组织结构完整性，判断心肌细胞是否存在排列紊乱等病理变化，同时观察有无炎症细胞浸润。

将1.8节制备的石蜡切片烘烤、脱蜡后，置于苏木精染液中染色5 min，用盐酸乙醇溶液分化1 s后冲洗返蓝；丽春红染色10 min后自来水冲洗；1%磷钼酸溶液分化，随后苯胺蓝染液滴染，最后脱水透明，封片。在光学显微镜下观察胶原纤维的沉积情况，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈粉红色，细胞核呈蓝色。心房肌纤维化水平（%）=（胶原纤维染色阳性面积÷心肌组织总面积）×100%。每张切片随机选取5个以上高倍视野进行定量分析，每组选取3张切片进行统计。

将1.8节制备的石蜡切片进行烘烤脱蜡后，用柠檬酸盐修复液进行抗原修复。滴加含有0.3% Triton-X的山羊血清封闭液封闭30 min后，加入α-Actinin抗体4 ℃孵育过夜，第2天室温孵育荧光二抗1 h。随后加入WGA染液（20 μg/mL），37 ℃避光孵育1 h，PBS洗涤后滴加DAPI，封片。使用ImageJ软件测量心肌细胞面积，手动勾画每个心肌细胞的边界，测量其横截面积。每组选取3张切片进行统计，每张切片测量不少于20个细胞，取平均值作为该张切片的代表值。

将1.8节纵切剩余的另一半心脏组织（每组2只大鼠）用冰冻切片包埋剂包埋后，于-20 ℃冰冻切片机中连续切片，厚度8～10 μm，防脱载玻片贴片后室温暂置1 h，然后置于-80 ℃保存。-80 ℃冰冻切片经纯水洗涤后，滴加含有0.3% Triton-X的山羊血清封闭液封闭30 min，随后用DHE染料（5 μmol/L）37 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤后滴加DAPI，封片。使用ImageJ软件测量每个视野的平均红色荧光强度，以此反映细胞氧化应激水平。相对荧光强度=（实验组平均荧光强度）/（对照组平均荧光强度）。每张切片随机选取5个以上高倍视野进行定量分析，每组选取3张切片进行统计。

将1.8节制备的石蜡切片进行烘烤、脱蜡后，用柠檬酸钠进行抗原修复。滴加含有0.3% Triton-X的柠檬酸钠溶液破膜10 min，按照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书配制TUNEL反应混合液，滴加于样本上，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗涤后滴加DAPI，封片。细胞凋亡率（%）=（TUNEL阳性细胞数÷DAPI阳性总细胞数）×100%。每张切片随机选取5个以上高倍视野进行定量分析，每组选取3张切片进行统计。

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。每组实验均重复3次以上，各组间数据采用x¯±s表示。数据满足正态分布时，两组间比较采用t检验。以P<0.05认为差异具有统计学意义。

在连续尾静脉注射 CaCl₂-ACh 混合溶液28 d后，通过大鼠体表心电图采集与解析系统和体外电刺激记录大鼠房颤诱发率（图1A）。体表心电图显示，实验组大鼠尾静脉注射CaCl₂-ACh后，即刻出现典型的房性心律失常心电图谱，即P波逐渐变得低矮、模糊，甚至消失，取而代之的是形态不规则、大小不等的f波，且f波频率快速而不规则，持续时间超过1 s，与文献报告^［4］的房颤心电图特征相一致；而对照组大鼠未出现上述变化，仍保持正常的窦性心律，P波形态正常、规律（图1B）。

利用MappingLab矩阵式多通道电生理标测系统检测离体心脏的房颤易感性，结果表明，对照组和实验组大鼠在单次50 Hz起搏2 s的电刺激下，房颤诱发率分别为6.7%和46.7%（图1C～D）。传导等时图显示，与对照组相比，实验组大鼠的心房电传导时间明显延长，电信号在心房内的传导速度减慢［（2.05±0.35）mm/ms vs（1.02±0.04）mm/ms，P<0.05］（图1E和G）。离散等时图显示，实验组大鼠心房电传导方向不规律，电信号传导的不均匀性和离散度显著增加［（1.78±0.19）ms/mm vs（2.94±0.11）ms/mm，P<0.01］（图1F～G），提示心房内不同区域的电活动存在明显差异，房颤易感性增强。

心房组织结构是其电生理活动的基础。给药28 d后，超声检查结果显示，与对照组相比，实验组大鼠的左心房前后径明显增大（P<0.05），左心室功能障碍，具体表现为左室射血分数和左室短轴缩短分数显著下降（P<0.01），而左室舒张末内径和左室收缩末内径虽然有所增加，但差异并不显著（表1、图2A）。

HE染色结果显示，实验组大鼠心房肌组织结构和细胞排列紊乱，且心脏较大，存在少许炎症细胞浸润（图2B）。实验组心体比（心脏质量与体重的比值）较对照组显著升高（P<0.05，图2C）。蛋白质印迹结果显示，实验组心房组织中促纤维化因子MMP-9和促炎因子IL-1β蛋白表达水平均明显增高（P<0.05），提示心房纤维化程度和炎症反应加剧（图2D～F）。Masson染色结果表明，实验组大鼠心房组织中胶原纤维沉积显著增加（图2G），纤维化面积显著大于对照组［（29.89±1.86）% vs（12.03±0.51）%，P<0.001］（图2H），进一步提示实验组大鼠出现心房纤维化。

WGA染色结果显示，实验组大鼠心房肌细胞肥大，细胞横截面积比对照组增加了约36.21 μm²［（215.04±8.44）μm² vs （178.83±4.20）μm²，P<0.05］（图3A、C）。DHE染色结果显示，实验组大鼠心房组织反映活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的红色荧光信号显著增强（P<0.001），说明自主神经调节剂可显著提高心房肌细胞的氧化应激水平（图3B、D）。TUNEL染色发现，实验组心房细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.01，图3B、E）。

房颤是临床上最常见的心律失常类型之一，其患病率随着全球人口老龄化加重以及生活方式的改变逐年上升^［5-6］。目前，房颤已成为心血管领域的重大公共卫生问题，给患者带来沉重负担，也对医疗资源造成巨大消耗^［7］。房颤的发生发展机制尚未完全明确，近期有研究发现神经体液调节失衡在房颤发生发展中发挥重要作用^［8-10］。本研究参考文献［11］，利用尾静脉注射自主神经调节剂的方法成功建立了大鼠房颤模型，并重点分析了实验组大鼠在心房电重塑、组织、细胞方面的病理变化，这对于深入研究房颤的发生机制、探索新的治疗方法具有极为重要的意义。

本研究采用的自主神经调节剂为CaCl₂和ACh。CaCl₂作为一种常用的化学试剂，能够增加细胞外Ca²⁺浓度，进而导致心肌细胞内钙超载，触发心肌细胞的异常电活动^［12］。ACh则是一种重要的神经递质，可通过激活副交感神经通路，影响心肌细胞的动作电位时程和传导特性^［13］。与既往研究一致，本研究通过尾静脉注射CaCl₂-ACh混合溶液的方式成功建立了大鼠房颤模型；不同之处在于，本研究优化了给药剂量并将造模周期延长至28 d。相比之下，有研究虽采用相同的大鼠品系和给药剂量，且周期长达5周，但未系统分析心房电传导速度与离散度等电生理指标^［14］；另有研究使用小鼠模型，但给药剂量较低（CaCl₂ 5 mg/mL，ACh 25 μg/mL，总剂量为0.1 mL/10 g）、注射时间较短，亦未评估电生理参数^［15］。针对现有模型周期偏短、电生理评估指标单一等不足^［11］，本研究在既往模型基础上优化了造模方案，并从不同层面观察了持续给药28 d后大鼠的心房电生理、心房组织结构、心肌细胞形态及氧化应激水平变化。

在电重构方面，实验组大鼠心房的电传导时间延长，传导方向不规律，传导时间离散度增加，这些电生理特性的改变表明心房电活动稳定性受损。CaCl₂-ACh联合使用引起心肌细胞损伤，导致左室射血分数和左室短轴缩短分数的改变更为显著，也进一步说明了心脏功能的下降。在心房肌组织层面，实验组大鼠的心房组织结构排列紊乱，胶原纤维沉积增多，心脏增厚，而心体比的升高更客观地反映了心脏形态改变。在心房肌细胞层面，实验组大鼠心肌细胞明显肥大，ROS生成量明显增多。心肌细胞肥大通常是心脏对各种病理刺激产生的一种代偿机制，然而，肥大过度可能引起心肌细胞功能障碍，从而对心脏的整体功能产生负面影响。过量的ROS可以通过多种机制对心肌细胞造成损伤，例如诱导脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤等^［16］。这些损伤可能导致心肌细胞膜的完整性受损、蛋白质功能丧失以及遗传物质突变，从而影响心肌细胞的正常生理功能。此外，ROS还可以激活炎症信号通路，引发炎症反应，促进心肌细胞的凋亡^［17］。在本研究中，实验组大鼠ROS水平升高，心肌组织凋亡水平增加。已有研究表明，ROS可能会直接攻击线粒体，导致线粒体呼吸链功能障碍，从而诱导细胞凋亡^［18］。ROS引发DNA损伤会激活p53，p53作为转录因子可上调多种促凋亡基因的表达，进一步促进细胞凋亡^［19］。这种状态进一步加剧了心房的电重构与结构重构，促进房颤的发生发展，使房颤长期持续^［20-21］。

目前，房颤模型的制备方法多样，包括利用乌头碱等药物诱导法，刺激迷走神经、快速心房起搏等电刺激起搏法，二尖瓣反流法，急性心房缺血等创伤法，缺氧法，基因编辑法等，但均存在一定的缺陷和不足^{［11， 22］}。其中，药物诱导法操作便利，模型建立相对较快，但稳定性欠佳，且乌头碱等药物毒性较强，可能会对机体造成其他不良影响^［23］。电刺激起搏法具有较高的成功率，但其操作复杂、机制不明确，且异位起搏具有偶然性及不确定性，对设备和技术要求较高，较难控制^［24］。其余方法也存在模型稳定性欠佳、操作复杂、成本较高等缺点。相比而言，尾静脉注射自主神经调节剂的方法操作简单，对动物整体生理状态影响较小，可通过调节细胞外Ca²⁺浓度和激活副交感神经通路，触发心肌细胞的异常电活动，从而稳定诱导心房电重构和结构重构；除大鼠之外，该方法还可应用到实验兔上^［25］。

需要指出，本研究仅在大鼠上进行评价，未与其他已有的房颤动物模型进行对比验证。尽管该模型在一定程度上模拟了房颤的电重构和结构重构，但动物模型与人类房颤模型在解剖结构、生理功能和疾病机制等方面仍存在差异，还需要结合更多指标进一步评估其对人体临床房颤的模拟程度和研究价值。本研究采用心体比反映心脏肥厚程度，但该指标易受28 d实验周期内大鼠体重波动的影响。尽管同期对照可部分抵消组间差异，但相较于心脑比，心体比仍存在一定局限性。此外，本研究每组仅纳入5只大鼠，样本量较小，可能导致统计效能不足，从而影响结果的稳定性，因此本研究设计中严格把控了动物的来源、批次、饲养条件及实验操作，以尽量减小个体差异。未来本研究组将进一步扩大样本量，以更充分评估该模型的可靠性和可重复性。另外，本研究主要聚焦于给药后28 d这一时间点，旨在评估模型在该节点的有效性与稳定性。后续研究将进一步拓展至多个时间节点，以动态追踪房颤发生发展过程，弥补当前单时间点观察的局限。

综上所述，连续28 d给予自主神经调节剂（CaCl₂- ACh混合液）能够有效诱导大鼠房颤发生。本研究获取的实验大鼠心房电生理、心肌组织、细胞层面的数据将为研究房颤发生机制、筛选抗房颤药物以及探索房颤相关信号通路提供可靠的数据支持。

李嘉菲, 张朕豪, 王硕, 等. 自主神经调节剂对房颤模型大鼠心房电重塑及组织病理变化的影响[J]. 实验动物与比较医学, 2026, 46(3): 321-331. DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.125.

LI J F, ZHANG Z H, WANG S, et al. Effects of autonomic neuromodulators on atrial electrical remodeling and histopathological changes in a rat model of atrial fibrillation[J].Lab Anim Comp Med, 2026, 46(3): 321-331. DOI: 10.12300/j. issn.1674-5817.2025.125.