石蜡切片及苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色是肺组织病理学检查中常用的方法，包括取材、固定、脱水、染色等步骤。已有的研究发现，不同的固定方法会影响后续的操作过程和最终的观察结果［4-5］。目前胎鼠肺组织的固定方法主要采用直接取肺浸润法和胎鼠整体浸润法［6-7］，但是前者在取肺过程中容易出现脏器塌陷、肺组织撕裂的问题，后者则存在气体难以排出、固定液渗透困难的问题。因此，亟需建立一种操作简便、能减轻胎鼠肺组织损伤并提高肺组织固定和脱水效率的固定方法。成年大鼠的肺组织固定方法主要有直接取肺浸润法、气管内灌注法和经循环系统灌注法等［8］。气管内灌注法是在大鼠开胸前将固定液从气管灌注到肺组织中，不仅能避免脏器塌陷，还可以使固定液充盈肺泡腔并排出肺内气体，从而充分固定肺组织［9］。但是胎鼠肺组织稚嫩、体积小且易碎，对于气管内灌注法能否用于胎鼠肺组织固定尚不清楚。经循环系统灌注法需要开胸暴露心脏［10］，剪开右心耳，从左心室注射生理盐水，至流出液澄清后注射固定液。该方法虽然可以保持肺泡的完整性，但由于胎鼠的脏器过小，难以进行心脏灌注操作。因此，本研究基于胎鼠生理结构的特殊性，尝试采用气管内灌注法固定胎鼠肺组织，并将该法细分为气管内灌注后取肺浸润法和气管内灌注后胎鼠整体浸润法两种方式，同时将其与目前常用的直接取肺浸润法和胎鼠整体浸润法作对比，从操作流程、肺组织整体形态、肺泡及肺支气管形态等多个角度进行综合评价，旨在为优化胎鼠肺组织的固定方案提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用SPF级雌性SD大鼠6只（10周龄，体重200~250 g），雄性大鼠2只（10周龄，体重300~350 g）。所有大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2021-0011］，质量合格证号为No.11001 1241111005434；饲养于北京中医药大学动物实验中心屏障环境动物房内［SYXK（京）2023-0011］，大鼠可自由活动、饮水和进食，12 h明暗交替，排除饮食、环境等可能对实验动物产生影响的因素。适应性饲养1周后，每日18∶00将雌鼠与雄鼠按照3：1合笼，次日7∶00制备阴道涂片，于光学显微镜下观察精子，将发现精子当日记为妊娠第0.5天。妊娠第0.5~20天，将雌、雄鼠分笼饲养且不限制其饮食、活动。实验中遵守动物实验“替代、减少、优化（replacement，reduction，refinement，3R）”伦理原则且予以人道主义关怀，通过北京中医药大学实验动物伦理委员会审批（审批号：BUCM-2024120403-4278）。雌鼠在麻醉剖宫取材后采用腹主动脉放血，急性大失血法安乐死；雄鼠在戊巴比妥钠麻醉后，采用颈椎脱臼法安乐死。
1.2 主要试剂与仪器
一次性使用末梢采血针（型号30G、批号2306119）购自天津华鸿科技股份有限公司；4%多聚甲醛溶液（批号GP2410310）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；无水乙醇（批号KDIEH057）购自北京伊诺凯科技有限公司；二甲苯（批号C16545166）和病理级切片石蜡（批号P815422）购自麦克林生化科技股份有限公司；苏木精（批号GR3434190-6）和伊红（批号1079515-4）染色液购自艾博抗（上海）贸易有限公司；超白粘附载玻片（批号80312-3161）和标准级显微镜盖玻片（批号80340-3610）购自江苏世泰实验器材有限公司；石蜡包埋机（型号EG1150H）和超薄切片机（型号RM2245）购自德国Leica公司；正置研究级显微镜（型号BX60）购自日本Olympus公司；组织切片扫描仪（型号Pannoramic MIDI）购自匈牙利3DHISTECH公司。
1.3 实验分组及操作
妊娠第20天，使用2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉孕鼠，进行剖宫取材。在每只孕鼠所产胎鼠中选取4只体重、生命体征与呼吸状态相近的健康存活胎鼠，按照随机数表法将其分为直接取肺浸润组、气管内灌注后取肺浸润组、胎鼠整体浸润组和气管内灌注后胎鼠整体浸润组，每组各6只，共24只。4组胎鼠肺组织的取材、灌注及固定流程如图1所示。
图1
图1
胎鼠肺组织四种固定方法的流程示意图
Figure 1
Flowchart of four fixation methods for fetal rat lung tissues
1.3.1 直接取肺浸润法
参考石恒捷等［6］的胎鼠肺组织固定方法进行操作。将胎鼠埋入冰屑内进行低温麻醉，该过程中胎鼠不直接接触冰面。至胎鼠足部反射消失后，使用Y15201弯尖镊轻柔固定胎鼠头部，用75%酒精棉球擦拭面颊区域，使面静脉丛充盈，用一次性使用末梢采血针刺破面静脉，进行面颊放血。放血后，用弯尖镊逐层剥开胎鼠胸壁，直至暴露胸骨，使用Y15103直型整形剪剪断胎鼠胸部前方、侧方和后方的肋骨，小心剪断与心脏、肺脏连接的胸部筋膜后，使用弯尖镊夹持气管下方约3 mm，轻柔地将胎鼠气管、心脏和肺脏完整取出，放入充满4%多聚甲醛溶液的2.5 mL冻存管中固定。固定24 h后，使用弯尖镊小心剥离心脏与肺脏间的筋膜，夹起心脏，用整形剪剪断心脏与肺脏连接的血管，将气管和肺组织用PBS缓慢冲洗2遍，浸入盛有30%蔗糖溶液的冻存管中，4 ℃保存，每2 d更换一次蔗糖溶液直至组织完全沉到管底。
1.3.2 气管内灌注后取肺浸润法
参考尚宏伟等［9］的成年大鼠肺组织固定方法进行操作。同1.3.1节对胎鼠进行麻醉和放血。放血后，用医用胶带将胎鼠仰卧位固定于鼠板上，在颈部正中使用弯尖镊逐层剥开颈部皮肤和肌肉，找到气管，使用弯尖镊小心夹断气管周围的肌肉和筋膜，在气管背侧方穿过一根用生理盐水浸润过的手术缝合线。使用0.5 mL一次性无菌胰岛素注射器抽取0.3 mL 4%多聚甲醛溶液，注射器针头朝向胎鼠胸部，与气管夹角呈15°进针，刺入气管约5 mm（避免戳破气管），用器械打结法在针尖上方约2 mm处打单结以固定气管和注射器针头。缓慢且匀速地将4%多聚甲醛溶液从气管注入肺组织，观察到胎鼠胸廓充盈后停止注射。缓慢抽离注射器针头，立即在原单结基础上用同样方法结扎气管，同1.3.1节进行取肺及后续的固定操作。
1.3.3 胎鼠整体浸润法
参考高瑕［7］的胎鼠肺组织固定方法进行操作。胎鼠麻醉和放血方法同1.3.1节。放血后将胎鼠整体放入10 mL充满4%多聚甲醛溶液的冻存管中固定。72 h后，留取胎鼠锁骨至肋骨下缘的胸段部位，切除其余组织，用PBS将截取部位冲洗2遍，浸入盛有30%蔗糖溶液的冻存管中，4 ℃保存，每2 d更换一次蔗糖溶液直至组织完全沉到管底。
1.3.4 气管内灌注后胎鼠整体浸润法
参考尚宏伟等［9］的成年大鼠肺组织固定方法，改良后进行操作。胎鼠麻醉和放血方法同1.3.1节。放血后，同1.3.2节方法行气管内灌注。后续切取及固定胸廓的操作同1.3.3节。
1.4 石蜡切片及HE染色
固定后的组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明及浸蜡处理后包埋成蜡块，制作成4 µm厚的切片，切片经脱蜡后行HR染色，染色后脱水、封片行镜下观察，使用配备×10目镜和×1物镜，以及×10目镜和×20物镜的光学显微镜观察切片。观察时，先在低倍镜（×10）下找到有典型特征的区域，再切换到高倍镜（×200）观察细胞形态和组织结构。使用组织切片扫描仪，以逐行扫描的方式对切片进行扫描，将扫描分辨率设置为0.27 μm/pixel，以获取高清晰度的切片图像用于后续分析和记录。
2 结果
2.1 胎鼠肺脏的大体观察比较
上述4种方法制备的组织经固定后，肉眼观察胎鼠肺脏与胸廓的大体形态。如图2A所示，直接取肺浸润组的肺叶皱缩、形状不规则，肺门处轮廓模糊，肺内残留的血液较多；气管内灌注后取肺浸润组的肺叶饱满、形状规则，肺门处轮廓清晰，肺内残留的血液较少；胎鼠整体浸润组与气管内灌注后胎鼠整体浸润组在大体观察下均未能看到肺脏，但能观察到胎鼠胸段脱水固定后的形态，其中，前者胸廓扁平、皮肤皱褶较少，后者胸廓充盈、皮肤褶皱较多。
图2
图2
四种固定方法下的胎鼠肺组织形态比较
Figure 2
Comparison of fetal rat lung tissue morphology using four fixation methods
2.2 低倍镜下胎鼠肺组织形态比较
2.3 高倍镜下胎鼠肺泡形态比较
图3
图3
四种固定方法下的胎鼠肺泡HE染色结果（×200）
Figure 3
Results of HE staining of fetal rat alveoli using four fixation methods （×200）
2.4 肺支气管组织学观察结果的比较
图4
图4
四种固定方法下的胎鼠肺支气管HE染色结果（×200）
Figure 4
Results of HE staining of fetal rat lung bronchi usng four fixation methods （×200）
3 讨论
组织固定是制作高质量病理切片的关键步骤之一，在组织病理学的研究中具有重要意义［11］。放血是组织取材及固定前的常用操作，它不仅可以减少血液对组织的污染和对染色的干扰，也可以大大减轻实验动物的痛苦［12］。胎鼠常用的取放血方式为断头放血法［13］，但是该方法会导致颈部血管内的血液随气管进入肺部，造成血液污染肺组织。因此，有研究先对大鼠进行气管下1/3处结扎，再在气管上1/3处断头放血以防止血液进入肺部，而后在结扎处下方进行气管内灌注［14］。但是胎鼠的气管短小，气管壁和血管壁较薄，先结扎后放血易划破气管和血管，使血液流入肺部，并导致后续灌注困难，所以本研究选择在与颈内静脉和颈外静脉连接的面静脉丛处先行放血，避免血液污染气管及肺泡腔。
肺部的空腔结构在胚胎期已经形成，它是肺脏进行气体交换的基础［15-17］。在生理状态下，气体交换由膈肌、肋间肌等呼吸肌的收缩和舒张协同实现：当呼吸肌收缩时，胸腔容积增加，胸腔内相对于体外大气压形成负压，肺部扩张；当呼吸肌舒张时，胸腔容积减小，胸腔负压回升，使肺部收缩。在死亡或开胸后，呼吸肌的功能丧失，胸腔内压接近外部大气压，胸腔容积减小、压力增加，肺泡塌陷伴间隔聚拢性增宽，肺支气管皱缩，肺内的组织结构难以区分。当肺泡内外压力达到平衡时，肺内气体无法排出，残留的气体会影响肺脏的固定和脱水效果［18］。因此，我们假设通过气管内灌注，可以使死亡胎鼠的肺脏再次充盈，并使组织固定液充分渗透，从而排出肺内气体，维持肺泡的原始形态。本研究结果显示，与未灌注组相比，灌注组的肺脏形态更加饱满，肺泡与肺支气管形态更规则、充盈，边缘更清晰。与我们的设想一致，在开胸前灌注固定液，可在肺组织未变形时尽可能维持肺部的充盈，同时从针头与气管的空隙中排出气体，从而更好地保持肺组织的生理形态。因此，灌注法比胎鼠整体浸润法更能保留原始胎鼠的肺组织结构，适用于组织病理学检查。
由于胎鼠脏器的大小、厚度和韧度均有别于成年鼠，为避免取材时损伤器官，有研究将肺脏保留在原位，取材时连同胸段一起切开［6］。取成年大鼠的肺脏时通常先断开锁骨和胸前的肋骨，暴露肺脏与心脏，而后将气管、心脏和肺脏一同取出［19-20］。但是胎鼠的肺脏非常娇嫩，仅截断胸前的肋骨容易因拉扯而使肺脏破损或变形。本研究为保护稚嫩的胎鼠肺脏，改进了取肺方法，即剪断胎鼠胸前方、侧方、后方的肋骨，小心剥离与肺脏连接的胸部筋膜，而后取出胎鼠的气管、心脏和肺脏。结果显示，此方法取出的肺组织经浸润固定后，表面有少量破损，但与整体浸润组的破损差异不明显，且在灌注方式相同的情况下，取肺浸润组与整体浸润组的肺泡形态均无明显差异，但是前者肺支气管形态及管壁细胞更清晰，且后者在切片时存在肺组织定位困难、实验耗材用量多的缺点。由此证明，本次研究所用的胎鼠肺脏取材方法不会破坏肺组织形态，且气管内灌注后取肺浸润组的肺组织整体形态更清晰完整。
虽然本研究中气管内灌注后取肺浸润组肺组织的整体形态、肺泡和肺支气管结构以及染色效果最优，但是该方法依然存在局限性：（1）可能会造成肺部伪影［21］，掩盖对肺炎的诊断，所以不适用于新生儿肺炎研究的动物模型；（2）应对胎鼠气管内灌注的固定液进行优化，例如固定液的种类、灌注量和灌注时间等，以减少阅片时的杂质污染。相信随着更多精细化实验试剂和耗材的出现，以及对动物及其胚胎发育的进一步了解，将会制备出更加符合人类健康研究的实验胎肺动物模型。
[引用本文]
刘力瑜, 嵇波, 刘小玄, 等. 大鼠胎儿期肺组织固定方法的探索[J]. 实验动 物 与 比 较 医 学, 2025, 45(4): 432-438. DOI: 10.12300/j. issn.1674-5817.2025.053.
LIU L Y, JI B, LIU X X, et al. Exploration of rat fetal lung tissuefixation methods[J]. Lab Anim Comp Med, 2025, 45(4): 432-438.DOI: 10.12300/j.issn.1674-5817.2025.053.
作者贡献声明
刘力瑜负责实施研究、初稿写作；
嵇波负责监督指导、提供行政及技术支持；
刘小玄、方洋、张玲、郭亭廷、全烨和李鹤文参与动物实验及实验方法设计；
刘翼天负责研究项目管理及写作核修。
医学伦理声明Medical Ethics Statement
本研究涉及的所有动物实验均已通过北京中医药大学实验动物伦理委员会审查（批准文号：BUCM-2024120403-4278）。所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行。
Ethics Approval and Patient Consent
All animal experiments involved in this study have been approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Beijing University of Chinese Medicine (Approval No.BUCM-2024120403-4278). All experimental processes were conducted in accordance with relevant laws,regulations,and rules on laboratory animals in China.
利益冲突声明
所有作者声明不存在利益冲突。
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