2015年, 第35卷, 第4期　
刊出日期：2015-08-25

  

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论著
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  5-脂氧化酶转基因小鼠表型初步研究

  张梅英, 杨葳, 吴红联, 董婉维, 周生来, 于洋, 王惟, 郭晓冲, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 265-270. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.001

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  目的 建立5-脂氧化酶(5-LO)高表达转基因小鼠模型,为动脉粥样硬化(AS)发病分子机 制的研究提供有应用价值的动物模型。方法 对5-LO转基因及正常对照小鼠分别选用RT-PCR、免疫组织化学、血脂、血压监测等方法进行分析实验。结果 5-LO及大鼠5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)免疫组织化学实验结果显示,在肾和肺中5-LO及FLAP的表达,转基因小鼠高于正常对照 组小鼠; RT-PCR实验结果显示, 转基因小鼠与正常对照小鼠比较在骨髓细胞、腹腔细胞、脾脏、 肾脏中白三烯介质及其受体均有不同程度的高表达。其中, 两种小鼠的腹腔细胞和骨髓细胞中白三烯A4(LTA4)、白三烯B4(LTB4)和半胱酰胺-白三烯受体2(Cys-LTR2)的表达存在差异( P<0.05), 脾和肾脏中LTB4、白三烯C4(LTC4)及Cys-LTR2的表达存在差异( P<0.05), 肾脏中半胱酰胺-白三烯受体1(Cys-LTR1)的表达存在差异( P<0.05)。C反应蛋白(CRP)、白介素-1b(IL-1b)、血小板衍 生因子(PDGF)、坏死因子-kB(NF-kB)等细胞因子检测结果显示, 在肾组织中转基因小鼠的各项指标显著高于正常对照小鼠( P<0.05); 血压测定结果显示, 转基因小鼠高于正常对照小鼠(P<0.05); 血脂检测结果显示, 两种小鼠未见明显差异(P>0.05)。结论 成功建立5-LO高表达转基因小鼠模型。
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  eNOS基因敲除大鼠模型的建立及表型初步研究

  杨葳, 周生来, 董婉维, 王惟, 于洋, 郭晓冲, 张婀娜, 王宏宇, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 271-276. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.002

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  目的 建立内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因敲除大鼠模型。方法 利用锌指核酸酶(ZFN)技术,通过显微注射的方法将编码eNOS特异性锌指酶的mRNA注入SD大鼠受精卵并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR产物测序的方法鉴定基因型。对敲除大鼠进 行外观观察,HE染色分析组织结构形态。通过Western blot分析敲除大鼠模型的心脏和肾脏组织中eNOS的表达情况。测量8~16周大鼠体质量,分析 eNOS基因敲除对体质量的影响。采用尾套法测量大鼠心率、血压、收缩压和舒张压,比较与野生型大鼠的差异。结果 通过显微注射方法共注射441枚受精卵,存活365枚,分别移入12只SD大鼠输卵管,共产出23只F0代大鼠。PCR 产物测序分析获得4只阳性原代大鼠,对8号大鼠筛选获得纯合子。阳性纯合子大鼠表现为肢体 缺损,HE染色显示动脉血管结构形态异常。Western blot结果显示,eNOS敲除大鼠的心脏和肾脏组织中不表达eNOS蛋白。敲除大鼠的体质量明显低于野生型大鼠,体质量增长幅度慢。血压、 收缩压、舒张压均高于野生型SD大鼠,有极显著差异(P <0.01)。eNOS敲除雌鼠心率低于野生型SD雌鼠( P<0.05)。eNOS敲除雄鼠心率与野生型SD雄鼠相比无统计学差异。结论 成功建立eNOS基因敲除大鼠模型,该模型或可成为高血压疾病研究的理想动物模型。
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  应用Talen法制备apoE基因敲除大鼠模型

  徐影琪, 李晓晶, 杨葳, 周生来, 于洋, 王惟, 张婀娜, 赵文, 张梅英, 郭大勇, 王宏宇, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 277-282. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.003

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  目的 应用转录激活因子样效应因子核酸酶(Talen)法制备载脂蛋白E( apoE)基因敲除大鼠模型,为进一步研究apoE基因功能,动脉粥样硬化(AS)疾病发病机制及治疗方法奠定基础。方法 设计并合成针对大鼠apoE基因的Talen序列,应用原核显微注射方法制备子代鼠。通过 PCR-测序及TA克隆-测序法检测仔鼠中apoE的突变,经传代及兄妹交配获得纯合型仔鼠,并对 其基因型进行鉴定。应用Western blot方法检测apoE^-/-仔鼠各组织中ApoE蛋白表达水平; 血清学分析血脂总胆固醇(CHO)及甘油三酯(TG)含量; 应用RT-PCR方法检测脂质代谢相关基因三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达。结果 经鉴定选取在第二外显子处缺失1 bp,造成开放阅读框移码突变的大鼠为阳性F0代仔鼠,该鼠经传代及筛选,最终获得 apoE^-/-大鼠。Western blot检测显示apoE^-/-鼠在心、肝、肾、脑、卵巢组织中未见ApoE蛋白的表达, 表明在该模型中成功实现了apoE基因的敲除。apoE ^-/-鼠血脂CHO、TG均高于野生SD大鼠,其中CHO水平呈现显 著性差异(P<0.05)。在apoE^-/- 鼠肝组织中ABCA1的表达降低,可能起到促进AS形成的作用。结论 应用Talen法成功制备apoE基因敲除SD大鼠; 经筛选获得了纯合型apoE^-/-大鼠,该模型实现了 apoE基因敲除,并表现为高血脂及AS性状。
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  金黄仓鼠Apoa5基因表达载体的构建及在不同组织器官中的差异表达

  董婉维, 张婀娜, 郭晓冲, 魏政立, 杨葳, 周生来, 赵文, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 283-287. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.004

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  目的 构建金黄仓鼠载脂蛋白A5(Apoa5)基因表达载体以及在不同组织中的表达差异分 析,为深入研究Apoa5基因在金黄仓鼠不同组织中功能奠定基础。方法 提取金黄仓鼠肝脏组织总RNA,采用RT-PCR方法对金黄仓鼠 Apoa5基因的cDNA进行克隆,构建Apoa5基因表达载 体并将其转染293T细胞,分别采用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。采用荧光定量PCR检测并分析 Apoa5 mRNA在8个组织中的表达量。结果 经PCR检测鉴定, Apoa5基因表达载体构建成功, 经测序分析金黄仓鼠Apoa5基因cDNA全长1 243 bp, 编码366个氨基酸,与人、大鼠、小鼠等物种比对,核苷酸和氨基酸序列均具有较高的同源性,金黄仓鼠与 人、大鼠、小鼠的氨基酸同源性分别为75%、84%、84%。转染293T细胞48 h后,RT-PCR和Western blot结果表明,Apoa5基因在mRNA和蛋白质水平都有表达。荧光定量PCR结果显示, Apoa5 mRNA在肝脏表达量最高,在脑和睾丸中中度表达,在心、脾脏、肺、肾、卵巢组织中低 度表达。结论 成功构建Apoa5基因表达载体并分析其在不同组织中的表达差异,为制备Apoa5 转基因金黄仓鼠动物模型以及研究Apoa5基因在金黄仓鼠脂类代谢中的功能奠定基础。
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  磁小体介导制备转基因猪模型

  陈克研, 陈振文, 董婉维, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 288-293. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.005

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  目的 以磁小体(BMP)和聚乙烯亚胺(PEI)为载体,通过睾丸注射精子介导法建立转基因猪 模型。方法 将实验室保存的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)绿色荧光蛋白(GFP)质粒与BMP和PEI 混匀,制备BMP-PEI- PLA2-GFP混合物,采用睾丸多点注射法接种巴马小型猪, 于接种后第2周、4周、6周至第20周采集精液,分别用RT-PCR和免疫荧光鉴定外源基因的表达情况; 取阳性精液,对母猪实施人工授精; PCR及RT-PCR对所产仔猪进行鉴定。结果 精液中GFP基因于接种后第4周首现并持续至第16周; 荧光显微镜检查可观察到GFP蛋白主要表达于精子顶体后区及精子 尾颈部; 经人工授精所产21头仔猪中,9头猪用PCR可检测GFP片段,用RT-PCR检测PLA2表 达,该9头猪的表达量明显高于其它猪,总阳性率达42.86%。结论 BMP和PEI结合可作为良好的携带外源基因的非病毒性载体,用该载体通过精子介导法可以达到迅速制备转基因猪的目的, 其成本低、方法简单、便捷。
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  应用Dicer1转基因小鼠建立黑色素瘤模型的研究

  李兆阳, 姜川, 郭晓冲, 杨葳, 董婉维, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 294-297. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.006

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  目的 应用Dicer1(编码蛋白属于RNA酶III家族)转基因小鼠建立黑色素瘤模型。方法 将小鼠黑色素瘤细胞株分别移植于Dicer1转基因鼠和C57BL/6J小鼠前肢腋下,观察两种小鼠的荷 瘤情况,包括移植瘤生长情况、移植瘤生长曲线。结果 与C57BL/6J小鼠组肿瘤比较,Dicer1转基因小鼠组的肿瘤成瘤时间短、肿瘤生长速度快、肿瘤体积大( P<0.05)。结论 应用Dicer1转基因小鼠建立了黑色素瘤模型,结果显示 Dicer1基因对黑色素瘤荷瘤有明显影响。
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  体外受精技术在大鼠胚胎冷冻保种中的应用

  周生来, 王维, 于洋, 杨葳, 张梅英, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 298-301. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.007

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  目的 探讨大鼠体外受精(IVF)技术在大鼠胚胎冷冻应用的可行性。方法 选用IVF-20溶液作为大鼠精子获能和受精培养液,改良大鼠1-细胞胚胎培养液(mR1ECM) 作为受精卵培养液,对SD 大鼠进行IVF,以输卵管灌流获得的2-细胞胚胎作为对照,并对发育良好的2-细胞胚胎实 施胚胎冷冻,1周后复苏并对存活胚胎采用输卵管移植。结果 采用灌流和IVF的方式分别获得胚胎463枚和588枚, 2-细胞胚胎301枚(65.01%)和 376枚(63.94%), 二者受精率相比无显著性差异(P>0.05); 采用两种方式获得的胚胎各冻存150枚, 复苏后形态正常胚胎分别为132枚(88.00%)和130枚(86.66%), 二者复苏率比较无显著性差异(P>0.05); 对存活的胚胎各移植5只受体, 分别产仔45只和22只, 二者的产仔率(32.14% vs 16.92%)有显著性差异(P<0.05)。结论 SD大鼠体外IVF技术在胚胎冷冻保种中应用是可行的, 将为以后基因工程SD大鼠的胚胎冷冻保种提供技术支持。
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  褪黑素对家兔肾上腺素所致肺水肿的保护机制初探

  吴骁, 杨小龙, 王丹

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 302-304. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.008

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  目的 探讨褪黑素对家兔肾上腺素诱发实验性肺水肿的作用。方法 随机将18只家兔分成正常对照组(对照组)、肾上腺素组(模型组)和褪黑素组(预防组),预防组经耳缘静脉注射褪 黑素10 mg/kg,30 min后模型组和预防组耳缘静脉分别注射肾上腺素1 mg/只诱发肺水肿,对照组则注射等量生理盐水。观察记录不同时间点呼吸频率的变化,比较肺系数及肺的病理组织学。结果 肾上腺素注射后,呼吸急促并维持一段时间;预防组与模型组比较,呼吸频率明显减慢且 肺体系数降低。病理组织学检查显示,模型组动物肺泡壁断裂,肺泡隔明显增宽;褪黑素明显减 轻上述的症状。结论 褪黑素对肾上腺素所致肺水肿具有保护作用。
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  一种制备结直肠癌原位移植瘤动物模型的方法

  杨喜花, 李耀平, 任连生, 赵莉莉, 杨永明, 阎磊, 白喜花

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 305-307. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.009

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  目的 设计一种制备小鼠肠原位移植瘤模型的新装置,并用其建立结直肠癌原位移植瘤 动物模型。方法 制备一种建立小鼠结直肠癌原位移植瘤的装置,使用该装置于KM小鼠结直肠 原位接种1×10⁶的H22肿瘤细胞,观察其成瘤情况及肿瘤转移情况。结果 将H22细胞接种于昆明小鼠结直肠部位, 小鼠平均生存时间为16.5±4.5 d。动物死亡后解剖,观察到6只动物全部形成肿瘤, 成瘤率为100%, 个别动物有骼淋巴结转移, 转移率为33.3%。结论 采用自制结直肠癌原位接种器可成功建立结直肠癌原位移植瘤动物模型,该方法具有操作简便,成瘤率高的优点。
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  磨牙石在大、小鼠饲养中的应用

  郎雪楠, 陈雪婷, 李兆阳, 郭晓冲, 周生来, 王维, 张婀娜, 赵文, 张梅英

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 308-310. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.010

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  目的 探讨磨牙石在大、小鼠饲养中对饲料消耗量与动物活动力的影响。方法 C57/BL6小鼠30只和SD大鼠30只按随机数字表法分为对照组(没放置磨牙石)和放置磨牙石组, 每组5笼。给予定量饲料, 称取和记录消耗饲料量并进行数据对比, 实验时间, 进行开场实验, 记录分析动物自主探究及活动能力。结果 对照组饲料消耗量明显高于放置磨牙石组, 磨牙石成为了大、小鼠日常休闲娱乐的玩具, 且到实验结束为止对照组与磨牙石组动物在活动力与探究行为上无明显差异( P<0.05)。结论 饲养笼内放置磨牙石既能节约饲料成本还能丰富动物的日常生活, 符合动物福利。
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  大/小鼠组织DNA两种提取方法的比较

  陈雪婷, 郎雪楠, 李兆阳, 张婀娜, 赵文, 董婉维, 周生来, 张梅英, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 311-315. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.011

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  目的 获取质量稳定的基因组DNA,快速鉴定模型动物基因型。方法 以鼠尾组织为实验材料,采用苯酚/氯仿法和改良煮沸法提取鼠基因组 DNA; 分别用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,采用PCR检测两种方法获得DNA的扩增效果。结果 酚/氯仿提取法提取的基因组DNA质量优于改良煮沸法,但两种方法获得的DNA模板均能成功应用PCR扩增进行 基因型鉴定,且改良煮沸法DNA提取具有无毒、简单、高效、便捷的优点。结论 大批量转基因大/小鼠基因型鉴定可以优先选择改良煮沸法提取基因组DNA。
经验交流
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  SD大鼠超数排卵的优化

  张婀娜, 郎雪楠, 赵文, 陈雪婷, 董婉维, 周生来, 于洋, 王惟, 张梅英, 郑志红

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 316-317. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.012

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  目的 通过对鼠龄及激素剂量的控制研究其对SD 大鼠排卵的影响。方法 分别采用三种不同剂量PMSG/hCG组合(PMSG/hCG:20 IU/20 IU、25 IU/25 IU、30 IU/30 IU)对4、5、6周龄的SD 大鼠进行超数排卵处理,以超数排卵总卵数、正常受精卵数、异型卵数作为评判标准,确 定最佳超排剂量及鼠龄。结果 20 IU剂量时,三种周龄大鼠分别获取胚胎 24.72枚、33.12枚、15.22枚,其中正常受精卵:21.58枚、29.1枚、13.1枚,异型卵: 2.01枚、1.01枚、2.12枚; 25 IU剂量时,三种周龄大鼠分别获取胚胎37.63枚、43.62枚、20.78枚,其中正常受精卵22.67枚、 38.6枚、18.5枚,异型卵: 2.82枚、1.23枚、2.28枚; 30 IU剂量时,三种周龄大鼠分别获取胚胎51.69枚、61.36枚、30.2枚,其中正常受精卵47.2枚、60.8枚、25.6枚, 异型卵: 1.23枚、0.56枚、1.3枚。结论 5周龄,激素剂量30 IU为大鼠超排的最适周龄及最佳激素剂量,为基因工程动物 制备及胚胎冷冻实验提供技术保障。
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  Beagle犬消声研究简报

  李兰芳, 郝智慧

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 318-319. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.013

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  美洲旱獭感染实验饲养管理及实验技术探讨

  薛康宁, 李晓燕, 李利利, 张贺源, 卢选成

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 320-322. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.014

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  一种通用型实验动物保定支架的设计

  银欢, 赵建文

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 326-327. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.015

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  目的 研制一种通用型实验动物保定支架。方法 根据动物的体型大小,调节固定支架的颈部、腹部固定装置。 结果 该固定支架可将动物固定,适合于给药、外科手术等实验操作。 结论 该保定支架可按实验动物的体型,准确定位、保定,通用性较强。
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  浅谈高校IVC动物实验室的管理制度

  孔丽娟, 王欣丽, 王成, 郝智慧

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 328-329. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.017

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  针对目前高校动物实验室的特点和管理现状以及所面临的问题,结合我校独立通风笼盒 (IVC)动物实验室的管理经验,在实验室现存的硬件设施条件下,从软件制度上着手加强管理,提高实验室的利用率,减少因人员带来的环境污染,从而更好地发挥高校公共实验室平台作用。
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  改革实验动物基本操作技能课程实验教学，培养创新型人才

  弓彦, 王春田

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 330-332. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.018

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  中医院校开展实验动物操作基本技能课程在高校人才培养环节中发挥着不可或缺的重要作用。传统的实验教学课程存在一些问题,限制了对大学生创新应用能力的培养。本文提出 一种优化组合大鼠实验内容的教学改革方法,有助于高校为社会培养更多实践能力强的创新型高素质人才。
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  医学实验动物专业教育和培训在医疗健康产业中的意义

  卢静, 陈柏安, 孙泉, 孟霞

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 333-334. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.019

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  医疗健康产业是中国未来国家发展战略的核心力量之一,人才是医疗健康产业发展的重要资源。医学实验动物专业人才是医疗健康发展中人才资源的重要组成。医学实验动物专业教育和培训将为医疗健康发展提供人力资源储备。因此认识医学实验动物专业教育和培训的重要性在 未来医疗健康产业发展中具有重要意义。
综述
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  自噬与帕金森疾病及相关性模型的研究进展

  李媛, 张梅英

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 335-340. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.020

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  帕金森病(Parkinson抯 disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病,严重影响老年人生活质量,目前其发病机制尚不明确,环境和遗传等因素均与其发病机制密切相关。越来越多的研究表明,线粒体功能异常和自噬损伤可能是导致PD发病的关键分子机制之一,因此,利用细胞模型 及PD动物模型研究自噬对PD发病机制的作用具有重要意义。本文就线粒体自噬与帕金森疾病相关性的研究进展做简要的介绍。
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  一氧化氮对动物胚胎附植影响的研究

  魏东, 孙全文

  实验动物与比较医学. 2015, 35(4): 341-344. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.021

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  一氧化氮(NO)作为一种特殊的生物传递信号分子,日益受到生命科学各领域的普遍重视。机体内的NO由一氧化氮合酶催化合成,是动物体内发挥多种生物学效应的自由基,是一种重要的生物信使,它几乎对哺乳动物的所有系统都会产生一定的作用。近几年的研究结果表明, NO对动物胚胎附植发挥着重要作用。