2014年, 第34卷, 第5期　
刊出日期：2014-10-25

  

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论著
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  Lepr^tm1Srcmo 基因敲入小鼠模型的建立及表型分析

  郑晋华, 何敏珠, 奚骏, 庄华, 王铸钢, 匡颖

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 345-352. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.001

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  目的 建立Lepr^tm1Srcmo基因敲入小鼠模型并开展相关表型分析,以满足我国糖尿病相关研究和药物研发的需求。方法 通过基因工程技术建立Lepr^tm1Srcmo基因敲入小鼠模型,测定三种基因型小鼠体质量、血糖变化;分别取三种基因型8月龄小鼠,检测血糖、血清胰岛素,以及肝功能、肾功能、血脂等血液生化指标,进行统计分析;对纯合子和野生型小鼠的肝脏、肾脏进行病理分析。结果 成功获得Lepr^tm1Srcmo基因敲入小鼠模型;初步表型分析显示：Lepr^tm1Srcmo基因敲入纯合子小鼠出生4周起即表现出过度肥胖,纯合子雄鼠表现出高血糖、高胰岛素、脂质代谢紊乱、肝肾功能异常等表型,13月龄Lepr^tm1Srcmo小鼠血糖恢复正常;病理检测发现,Lepr^tm1Srcmo小鼠肝肿大,并出现肝细胞空泡化等脂肪变性现象,以及肾小球肥大等病理改变。结论 该模型的建立为进一步研究2型糖尿病发病机制及治疗方法奠定了基础。
  
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  Sumf2与Sumf1可能存在代偿性的相互作用以维持硫酸酯酶的活性不变

  周涛, 张洪信, 朱后保, 唐凌云, 匡昉哲, 王铸钢

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 353-359. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.002

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  目的 通过Sumf2(硫酸酯酶修饰因子2)基因剔除小鼠来研究Sumf2在分子水平、细胞水平及组织器官水平的生物学功能及其与硫酸酯酶活性的关系。方法 用免疫荧光共定位的方法观察小鼠Sumf2的细胞定位情况;用组织或细胞蛋白与4种硫酸酯酶特异的底物反应,通过检测产物的生成量来计算硫酸酯酶的活性;用MTT的方法检测小鼠胚胎成纤维细胞的增殖能力;通过Alcian blue染色观察硫酸酯酶的底物葡糖氨基聚糖是否堆积在组织中,用qPCR的方法检测Sumf1的表达情况。结果 激光共聚焦显微镜结果证实小鼠Sumf2定位于内质网上;检测四种芳香族硫酸酯酶的酶活性和小鼠胚胎成纤维细胞的增殖能力,测定结果显示：基因缺失小鼠的检测结果都略低于野生型小鼠,但并未达到显著性水平;组织病理及葡糖氨基聚糖类染色并未发现基因剔除小鼠与野生型小鼠有明显差异;qPCR的结果显示Sumf2基因敲除小鼠中Sumf1的表达量明显下调。结论 Sumf2定位于内质网上,体内缺失Sumf2后代偿性地下调Sumf1的表达从而使得硫酸酯酶活性维持不变。
  
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  跑台合并撞击方式诱导的大鼠踝前撞击综合征模型

  曾贵刚, 李峻, 彭海东, 姜虹旭, 张申

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 360-364. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.003

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  目的 采用“跑台+撞击”交替刺激踝关节的方式制作大鼠踝前撞击综合征模型,并进行相应的评价。方法 将40只SD大鼠随机分为空白组、跑台组、撞击组和跑台+撞击组4组,每组各10只,空白组不处理,跑台组大鼠置于跑台,每日30 min,每周5 d,跑台平板斜度30°,履带传输速度12 m/min,进行4周跑台训练;撞击组大鼠固定右侧踝关节后,采用撞击装置撞击踝关节,单次撞击能量4.5 J,每日撞击300次,每周5 d,连续30 d。跑台+撞击组大鼠采用跑台与撞击仪共同处置,仪器参数设置同上两组。实验的10 d、20 d、30 d对各组大鼠进行踝关节屈伸疼痛评分、踝关节体积测定,实验30 d进行微计算机断层扫描技术(Micro CT)、病理学检测。结果 跑台+撞击组踝关节屈伸疼痛评分、踝关节体积在各个检测节点均显著高于其他两组,差异具有统计学意义(P<0.05); 跑台+撞击组踝关节Micro CT及软骨标本大体观察以轻度或中度病变为主,严重程度及评分与其余各组有显著性差异(P<0.05)。结论 跑台+撞击可以制作较为理想的踝前撞击综合征模型,其病情分期类似于骨性关节炎的早期及中期。
  
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  长爪沙鼠高脂血症的初步研究

  刘月环, 王志远, 杜江涛, 吴旧生, 余陈欢, 陈文文, 应华忠

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 365-371. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.004

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  目的 初步建立长爪沙鼠自发型高脂血症模型的血清脂蛋白琼脂糖电泳检测方法和肠菌PCR-DGGE检测方法,用于今后评价沙鼠高脂血症模型。方法 选取444只长爪沙鼠,按性别年龄分组后CO₂麻醉,取血液及肝脏标本,用于血清转氨酶、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等指标的检测以及肝脏病理学的观察,血清脂蛋白电泳(琼脂糖电泳)进行高脂分类; 取小肠、盲肠内容物用PCR-DGGE技术进行肠道微生物多样性检查,同时参照人类的高脂血症分类标准,对高龄组(平均12.81月龄)个体进行了高脂血症的分型。结果 约有10%~30%高龄组沙鼠其血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、TG、TC、血糖(GLU)等指标明显高于低龄组(平均4.72月龄)沙鼠。病理学检查发现,高龄组肝脏出现较为明显的脂肪变性,而低龄组鼠肝脏无异常发现。DGGE结果表明,高龄组与低龄组沙鼠呈现出不同的带谱,后者条带数明显多于前者。高龄鼠从血脂指标上可分为五种类型,以对应于人的Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。结论 高沙鼠的自发性高脂血症或可以作为一个潜在的模型研究,琼脂糖电泳法和PCR-DGGE法或可作为评价高脂血症沙鼠模型的补充方法。
  
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  小剂量辐射比格犬模型的初步研究

  谭洪玲, 马增春, 赵永红, 王宇光, 肖成荣, 梁乾德, 汤响林, 孙敬翔, 高月

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 372-376. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.005

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  目的 观察不同剂量⁶⁰Coγ射线照射比格犬后外周血象的变化,为小剂量辐射防护新药评价建立动物模型。方法 雄性比格犬24只分为5组: 0.3 Gy连续5 d屏蔽组,0.6 Gy连续3 d屏蔽组和连续5d屏蔽组,1 Gy 1次照射屏蔽组,不屏蔽组1.1 Gy,连续观察30 d。临床指标有体温、体质量、临床症状等;分别在照前和照后不同时间检测外周血象。结果 0.6 Gy连续5 d照射组动物存活率为33%,其余各组均全部存活。0.6 Gy连续3 d照射白细胞和血小板均在1~23 d明显降低,0.6 Gy连续5 d照射白细胞和血小板均在1~25 d明显降低,1.0 Gy照射白细胞在7~21 d明显降低、血小板在11~17 d明显降低。0.6 Gy连续3 d照射红细胞在照后5~15 d、血红蛋白在5 d明显降低;0.6 Gy连续5 d照射红细胞在照后13~25 d明显降低。0.6 Gy连续5 d照射血红蛋白在照后13~25 d明显降低。结论 综合存活率、临床症状、外周血指标变化等,0.6 Gy连续3 d照射可作为小剂量辐射防护药物的药效学评价模型。
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  不同采血方法对大鼠内分泌及血常规相关指标的影响

  吴剑平, 鞠晓云, 范乃兵

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 377-380. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.006

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  目的 比较剪尾、尾静脉切割和眼眶穿刺3种采血对大鼠内分泌及血常规指标的影响,探讨适用于大鼠连续多次采血的优选方法。方法 选择剪尾、尾静脉切割和眼眶穿刺3种采血方法,分别在0 min、20 min、60 min、120 min 时间点对Wistar大鼠进行4次采血,测定各组皮质酮(CORT)、血糖(GLU)及血常规指标,并与常规饲养不予任何实验处理作为空白对照组。分析不同采血方法对大鼠上述指标的影响。结果 与空白对照组相比,3个采血组的血清CORT均有显著升高, 同时眼眶穿刺采血组CORT显著高于其他两组。4次采血过程中, 剪尾采血和尾静脉切割采血对GLU均有一定影响,但眼眶穿刺采血会造成GLU有超过3 mmol/L的大幅波动。三个采血组比较,眼眶穿刺采血组的初始GLU显著高于其他两组,同时三组之间白细胞总数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)和血小板数(PLT)等血常规指标均有显著性差异。结论 尾静脉切割和剪尾采血为相对优化的采血方法, 适用于大鼠连续多次采血, 口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)不宜采用眼眶穿刺采血。不同采血途径会造成血常规和血糖测定值的明显差异。
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  BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鉴定

  罗肖, 魏双羽, 贾如, 姚婷, 张燕茹, 师小博, 闫剑群

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 381-385. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.007

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  目的 探讨BAMBI^-/-小鼠的繁殖和鉴定方法,筛选出足够数量的BAMBI^-/-小鼠,为研究BAMBI基因在肥胖、能量代谢等方面的生理功能提供实验动物。方法 将引进的2对BAMBI^-/-小鼠扩繁后,以与背景品系C57BL/6J野生型(WT)回交的方式获得BAMBI+/-小鼠,再将BAMBI^+/-小鼠进行互交大量繁殖。提取幼鼠尾部组织DNA,利用PCR方法鉴定基因型;选取BAMBI^-/-小鼠取肩胛部位棕色脂肪组织(BAT),腹股沟部位皮下白色脂肪组织(sWAT),性腺周围白色脂肪组织(gWAT)和肝脏,利用实时 PCR方法检测BAMBI mRNA的表达量。结果 BAMBI+/-小鼠互交扩繁,短期能获得大量小鼠;C57BL/6J野生型(WT)、BAMBI^+/-和BAMBI^-/-各表型结果基本符合孟德尔遗传规律;BAMBI^-/-小鼠敲除效率理想。结论 BAMBI^+/-小鼠互交是繁育BAMBI^-/-小鼠的较好方法;PCR方法能够准确鉴定BAMBI^-/-小鼠。
  
经验交流
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  先天性白内障大鼠主要脏器重量与脏器系数

  田小芸, 赵志刚, 许龙祥, 董敏, 恽时锋

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 386-388. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.008

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  目的 了解先天性白内障大鼠的脏器重量和脏器系数,为该鼠的使用提供基础数据。方法 取自繁白内障大鼠、小眼白内障大鼠及SD正常对照雌雄大鼠,每组各15只。麻醉后取血,然后采集各脏器,称重并计算脏器系数。结果 性别间比较,白内障大鼠的心、肝、脾、肺、肾和肾上腺系数雌雄间有差异(P<0.01或P<0.05); 小眼白内障大鼠的肺、肾上腺和胰腺系数雌雄间有差异(P<0.01或P<0.05); 正常对照组的脾、肺、肾和肾上腺系数雌雄间有差异(P<0.01或P<0.05)。白内障、小眼白内障大鼠与正常对照组雄性大鼠比,肾系数有差异(P<0.05),雌性与正常对照大鼠比肾上腺系数差异非常显著(P<0.01)。结论 白内障、小眼白内障与正常对照大鼠的脏器重量与脏器系数间存在一定的差异。
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  溶血对大鼠生化指标的影响及其结果校正关系的探讨

  刘珍清, 王晓波, 刘颖

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 389-392. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.009

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  目的 探讨不同溶血程度对生化指标的影响,并对溶血与生化指标变化值的相关性进行回归分析。方法 用全自动生化分析仪测定大鼠的不同溶血度血清样本中磷(P)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)生化指标值。结果 轻度溶血对生化指标测定值影响不大;中度和重度溶血对P、UA、TC、TP、ALP、BUN、ALB的指标测定值有影响,中度和重度溶血血清与正常血清生化指标测定值之间的差异有统计学意义(P<0.05); 重度溶血对TG的指标测定值有影响,重度溶血血清与正常血清生化指标测定值之间的差异有统计学意义(P<0.05); 不同程度溶血对GLU的测定值影响不大,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 不同程度的溶血对生化常规指标值产生不同程度的影响,不同生化指标的检测结果可采用相关回归方程进行校正。
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  加强实验动物质量检测实验室参与能力验证工作

  贺争鸣, 岳秉飞, 巩薇, 付瑞, 邢进, 王洪

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 393-395. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.010

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  了解实验动物质量检测网络工作现状,浅析检测机构能力验证的重要性及存在的问题,提出能力验证中需注意的关键点。 总结和分析目前我国实验动物质量检测实验室能力验证工作现状。今后还应加强和完善能力验证工作,为促进我国实验动物质量检测机构能力验证工作提供思路。
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  浅谈药品生产企业中实验动物的规范化管理

  蔡亦泠, 郑文捷, 宋志南, 王晓明

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 396-399. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.011

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  实验动物饲养管理和使用在药品质量控制中占据十分重要地位。为保障和提高实验动物及动物实验质量,保证人类用药安全有效,必须不断探索完善实验动物的科学化和规范化管理模式。本文结合药品生产质量管理规范(GMP)以及国家相关规定,针对实验动物的管理难点,探讨了一些具体的解决办法。
裸鼹鼠研究专题
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  裸鼹鼠不同组织中低氧相关基因的表达

  肖邦, 赵善民, 林丽芳, 王运慧, 宫晨, 余琛琳, 张璐, 汤球, 孙伟, 崔淑芳

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 400-404. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.012

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  目的 检测幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中低氧相关基因的表达水平, 分析裸鼹鼠耐低氧的分子机制。方法 分别提取幼年与成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中mRNA,采用RT-PCR方法检测低氧相关HIF-1α、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF基因的表达。结果 成年裸鼹鼠肺脏、肝脏和脑组织中HIF-1α、VEGFb、FLT-1、FLT-3、Fiz1、NKRF的表达水平显著高于幼年裸鼹鼠。结论 裸鼹鼠体内低氧相关基因在不同年龄阶段表达水平不同。
  
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  低氧对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞自噬水平及凋亡的影响

  赵善民, 林丽芳, 肖邦, 王运慧, 宫晨, 张璐, 余琛琳, 汤球, 孙伟, 崔淑芳

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 405-410. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.013

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  目的 比较裸鼹鼠成纤维细胞常氧与低氧条件下自噬与凋亡水平。方法 分别采用低氧(3% O₂)与常氧(20% O₂)培养裸鼹鼠皮肤成纤维细胞,采用Western blotting、RT-PCR等方法检测自噬相关基因Beclin 1、LC3的表达,并用流式细胞术检测低氧与常氧条件下裸鼹鼠成纤维细胞凋亡水平。结果 裸鼹鼠皮肤成纤维细胞在低氧与常氧处理24 h时,LC3Ⅱ蛋白的表达量并无明显差异,而低氧处理48 h后LC3Ⅱ蛋白的表达量显著高于常氧组,并且裸鼹鼠成纤维细胞随着低氧培养时间的延长,LC3Ⅱ蛋白表达升高。流式细胞术结果显现低氧处理组裸鼹鼠皮肤成纤维细胞凋亡率显著低于常氧组。结论 裸鼹鼠皮肤成纤维细胞可以通过提高自噬水平适应低氧环境,这为今后深入研究裸鼹鼠耐低氧机制提供了参考。
  
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  Poly I:C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响

  林丽芳, 肖邦, 赵善民, 汤球, 余琛琳, 孙伟, 张璐, 蔡丽萍, 徐晨, 程继帅, 崔淑芳

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 411-416. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.014

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  目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(Poly I:C)对裸鼹鼠自噬水平的影响。方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I:C给药组和对照组,分别腹腔注射PolyI:C和生理盐水。Poly I:C给药12 h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况。结果 Poly I:C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张; 实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调(P<0.05),而C57BL/6小鼠则下调(P<0.05)。结论 Poly I:C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I:C损伤的作用。
  
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  裸鼹鼠外周血白细胞免疫相关因子mRNA表达水平的检测

  林丽芳, 肖邦, 赵善民, 汤球, 余琛琳, 孙伟, 张璐, 蔡丽萍, 徐晨, 程继帅, 崔淑芳

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 417-421. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.015

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  目的 检测生长期和成年期裸鼹鼠外周血白细胞免疫相关因子mRNA表达水平,以了解裸鼹鼠的正常免疫水平。方法 通过眼眶静脉丛采集6月龄和12月龄裸鼹鼠外周血,提取外周血白细胞mRNA,反转录成cDNA后,实时定量PCR检测各组裸鼹鼠外周血中白细胞IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达水平。结果 除了IFN-γ、IL-4各组间无显著差异,6月龄裸鼹鼠的IL-2、TNF-α显著高于12月龄裸鼹鼠,尤其是6月龄雄性裸鼹鼠的表达水平显著较高。而细胞因子IL-1, IL-6中,6月龄雄性裸鼹鼠的表达水平也显著高于12月龄裸鼹鼠。另外,对细胞因子IL-8、IL-12表达检测结果表明,12月龄雌性裸鼹鼠的IL-8表达水平最低,而12月龄雄性裸鼹鼠的IL-12表达最低。结论 生长期雄性裸鼹鼠的细胞免疫水平和体液免疫水平均高于同龄的雌性动物和成年动物。
  
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  裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究

  肖邦, 赵善民, 林丽芳, 王运慧, 宫晨, 余琛琳, 张璐, 汤球, 孙伟, 崔淑芳

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 422-427. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.016

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  目的 探讨多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(PolyI:C)诱导下裸鼹鼠肺脏、肠组织的病理变化以及低氧诱导因子(HIF-1α)和坏死因子(NF-κB)信号通路关键基因的表达水平, 分析裸鼹鼠抵抗病毒可能的分子机制。方法 裸鼹鼠分为PolyI:C处理组、生理盐水对照组。注射12 h后处死动物,肺脏和肠组织切片经HE染色后观察病理变化; 提取裸鼹鼠肺脏、肠组织中mRNA,采用半定量RT-PCR方法检测基因HIF-1α、VEGFb(血管内皮生长因子b)、VEGF c(血管内皮生长因子c)、FLT-1(血管内皮生长因子受体1)、Fiz1(血管内皮生长因子受体3结合锌指蛋白1)、NKRF(转录因子NRF蛋白)的表达水平。结果 与对照组相比,PolyI:C处理组的肺脏和肠组织病理变化不明显,而所检测基因的表达水平几乎都显著下降,仅肠组织中的FIZ1的表达水平有所上升(P>0.05)。结论 PolyI:C对裸鼹鼠没有产生明显的致病作用,它不能诱导裸鼹鼠体内HIF-1α和NF-κB信号通路活化,提示裸鼹鼠可能通过抑制相关信号通路的活性促使体内受感染的靶细胞迅速凋亡,从而清除入侵的病原体。
  
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  抑癌基因p53在裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异

  赵善民, 肖邦, 王运慧, 林丽芳, 余琛琳, 张璐, 宫晨, 汤球, 孙伟, 崔淑芳

  实验动物与比较医学. 2014, 34(5): 428-432. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-5817.2014.05.017

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  目的 比较裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠组织中抑癌基因p53表达的差异,并分析p53基因在不同年龄裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异。方法 采用Western blotting 检测新生裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏中p53蛋白的表达,进一步比较了不同年龄裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肠道中p53蛋白的表达,同时采用RT- PCR检测了裸鼹鼠肝脏、肺脏中p53基因的转录水平。以及低氧处理裸鼹鼠皮肤成纤维细胞中p53基因的表达水平。结果 新生裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏组织中p53蛋白的表达低于新生C57BL/6J小鼠组织,成年裸鼹鼠肝脏、肺脏组织中p53蛋白表达量亦显著高于幼年裸鼹鼠。裸鼹鼠成纤维细胞在低氧条件下p53蛋白的表达量较高, 并且随着低氧处理时间的延长, 表达量进一步升高。结论 新生裸鼹鼠组织中抑癌基因p53表达水平显著低于C57BL/6J小鼠, 并且p53基因随着年龄增长而发生变化。